Biofisica, premios nobel

El potencial de toxicidad de los productos farmacéuticos encontrados en el estuario del río Duero (Portugal): Evaluación de los impactos en el hígado de los peces, mediante histopatología, estereología, vitelogenina e inmunohistoquímica del CYP1A, tras exposiciones subagudas del modelo de pez cebra

Se probaron enfoques cualitativos y cuantitativos para evaluar los efectos en el hígado del pez cebra tras exposiciones subagudas de determinados productos farmacéuticos. Se probaron la carbamazepina, el ácido fenofíbrico, el propranolol, el sulfametoxazol y la trimetoprima individualmente y en mezclas, incluyendo niveles ambientales bajos. En general, los datos mostraron reacciones específicas por sexo en el hígado, observándose las principales alteraciones en los machos. Los machos tratados con propranolol, ácido fenofíbrico y con mezclas, mostraron un aumento de la inmunotinción de vitelogenina, en comparación con el control. Los machos también evidenciaron una tendencia al aumento de la masa hepática, tras las exposiciones individuales y de mezcla. El volumen nuclear ponderado de los hepatocitos fue elevado en los machos tras las exposiciones a cualquiera de las mezclas, lo que, junto con la mayor eosinofilia citoplasmática y los cambios en la inmunorreactividad del citocromo P450 1A, apuntan a un aumento de la actividad metabólica/de desintoxicación. Estas investigaciones revelaron impactos distintos según el tipo de exposición, y reforzaron la importancia de estudiar los compuestos no esteroideos en mezclas, incluyendo los niveles ambientales y ambos sexos.

Histología de los hepatocitos, inmunohistoquímica para CYP1A y v¯ v nuclear

 La determinación estereológica del v¯ v nuclear de los hepatocitos integra la información del tamaño nuclear medio y la variabilidad del tamaño en cada grupo de tratamiento. Las alteraciones en el volumen e incluso en la forma del núcleo se han asociado con el aumento de la actividad metabólica en diversas circunstancias, tanto en condiciones de salud como de enfermedad (Henrique et al., 1997; Noorafshan et al., 2005; Rocha et al., 2009). En consecuencia, el aumento del tamaño nuclear de los hepatocitos puede utilizarse como un biomarcador inespecífico de reacción a las exposiciones a distintos compuestos tóxicos (Figueiredo-Fernandes et al., 2006b; Moutou et al., 1997; ParisPalacios y Biagianti-Risbourg, 2006). Nuestros datos concuerdan con este patrón en el caso de los machos después de ambas exposiciones a la mezcla. Así, el aumento del v¯ v nuclear de los hepatocitos tras las exposiciones a las mezclas, junto con el aumento del tono de tinción del citoplasma de las células hepáticas (fuerte aumento de la eosinofilia, también con un ligero aumento de la basofilia), sugiere claramente una mayor actividad metabólica hepatocelular para adaptarse y evitar la toxicidad. En un contexto toxicológico, el aumento de la eosinofilia hepatocítica suele reflejar la proliferación del retículo endoplasmático liso, que tiene un papel clave en la desintoxicación de los xenobióticos. La basofilia tenue está ciertamente relacionada con el pequeño aumento del retículo endoplásmico rugoso, como consecuencia de una mayor producción de proteínas. Además, el hígado de los peces cebra hembra y macho expuestos a MXA y MXB mostró una inmunotinción de CYP1A de moderada a sustancial en el citoplasma de los hepatocitos. Esta respuesta de inducción del CYP1A sugiere un proceso de biotransformación incrementado, lo cual es consistente con los datos reportados anteriormente. Pocos estudios in vitro han demostrado la capacidad de algunos de los compuestos seleccionados para inhibir o simplemente no producir ningún efecto en la actividad de la 7-etoxirresorufina-o-detilasa (EROD) (Gagné et al., 2006; Laville et al., 2004; Li et al., 2011), comúnmente utilizada como marcador de la función del CYP1A. Por otro lado, por ejemplo, la PHO había revelado consistentemente su potencial para inducir el CYP1A in vitro (Laville et al., 2004) y, recientemente, incluso in vivo a 1mg/L (Bartram et al., 2011). En general, estos productos farmacéuticos, al menos en un contexto de mezcla, parecen alterar la expresión y la distribución citoplasmática del CYP1A, lo que lógicamente puede afectar al metabolismo y la toxicidad de los compuestos. A diferencia de los resultados de las mezclas, las hembras y los machos expuestos individualmente a SMX y TMP mostraron una evidente disminución de la v¯ v nuclear de los hepatocitos, lo que puede parecer contradictorio con lo observado para las mezclas. Sin embargo, debemos tener en cuenta que las adaptaciones de los tóxicos hepáticos (que suelen implicar la inducción de enzimas) pueden implicar transitoriamente una hiperplasia de los hepatocitos (Maronpot et al., 2010) y, por tanto, procesos mitóticos que den lugar a células hepáticas más pequeñas, manteniendo, al menos durante un breve periodo de tiempo, o incluso aumentando inmediatamente la masa hepática, como creemos que es el caso de las hembras y los machos, respectivamente. Independientemente del mecanismo que subyace al hecho de que la v¯ v nuclear disminuyó sólo para el SMX y el TMP, mientras que aumentó en otras situaciones, el punto práctico principal no es realmente la dirección (arriba frente a abajo) en la que cambia la v¯ v, sino que, independientemente de la situación, cambia, evidenciando alteraciones morfológicas y funcionales reactivas en las células.

Por supuesto que, a la luz de lo anterior, se deben planificar futuras estrategias planificadas para comprender las distintas respuestas intersexuales después de las exposiciones a productos farmacéuticos individuales y mixtos. Sin embargo, frente a los datos actuales y anteriores (Figueiredo-Fernandes et al., 2006b) en este momento los cambios nucleares v¯ v en los hepatocitos parecen ser un buen parámetro para reflejar impactos inducidos por tóxicos a nivel celular. Además, a pesar de las mayores concentraciones de MXB (10.000 veces más que MXA) se obtuvieron diferencias relativamente pequeñas entre ambas mezclas probadas. Estos resultados sugieren la hipótesis de que a partir de un determinado umbral de toxicidad, se alcanza una respuesta de meseta lo que hace que la correlación directa de mayor dosis de exposición versus mayor efecto tóxico observado, no sea válida en esta situación. Futuros estudios in vitro con cultivos de hepatocitos primarios podría ser una clave para acceder a las posibles relaciones dosis-respuesta de los fármacos utilizados en cuanto a las alteraciones encontradas encontradas aquí in vivo.

Inmunohistoquímica para Vtg

Se llevaron a cabo análisis cualitativos de la inducción de Vtg tras el impacto de ambos experimentos farmacéuticos en el hígado masculino. El uso de la inmunohistoquímica demostró ser una técnica rápida y rentable para este primer análisis. La Vtg es una fosfolipoglicoproteína que se produce normalmente en el hígado de las hembras de todos los vertebrados ovíparos bajo estímulo estrogénico, y posteriormente es secuestrada de la circulación por y se incorpora a los ovocitos maduros (Lubzens et al., 2010). Los peces macho también pueden presentar niveles de Vtg en sangre pero en un patrón muy residual (Copeland et al., 1986). Más allá de la expresión de Vtg en el hígado, se ha demostrado su presencia en otros tejidos extrahepáticos del pez cebra, como el intestino, el ovario, el cerebro y el corazón (Wang et al., 2005; Yin et al., 2009). La expresión de la Vtg en los peces machos o inmaduros está ampliamente reconocida hoy en día como un biomarcador de la alteración estrogénica (Hutchinson et al., 2006), aunque pruebas recientes han demostrado que la expresión de la Vtg en los peces también puede estar regulada por compuestos no estrogénicos, como los mediadores adrenérgicos (Ma et al., 2009; Yin et al., 2009). Nuestros resultados son indicativos de los efectos de regulación al alza de la expresión de Vtg por parte de productos farmacéuticos no esteroideos. En ambos experimentos (I y II), los machos tratados individualmente con PHO y FA y con ambas mezclas (MXA y MXB) mostraron un aumento de la inmunotinción en comparación con los machos de los grupos de control. La intensidad de la tinción observada para la mezcla más alta (grupo MXB) fue más pronunciada que para la más baja (grupo MXA), lo que denota una influencia de las concentraciones más altas. En general, las principales localizaciones de la inmunorreactividad para la Vtg en el hígado se encontraban en la región perinuclear del hepatocito, donde predominan el retículo endoplásmico y los cuerpos de Golgi son predominantes, y en los sinusoides, lo que sugiere la liberación en la circulación sistémica. Nuestros hallazgos están en consonancia con la localización de la Vtg comunicada por otros (Bieberstein et al., 1999; Kobayashi et al., 2005; Van der Ven et al., 2003). En consecuencia, la inducción de la Vtg por parte de nuestra selección de fármacos debería considerarse a partir de ahora como un indicador de su potencial, aún muy inexplorado, para perturbar (solo o junto con otros xenoestrógenos clásicos) el sistema reproductivo de los peces de los peces, por lo que es necesario seguir investigando investigación, en particular en lo que respecta a los impactos gonadales de los compuestos y los niveles probados aquí.

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