Biorremediacion de metales pesados mediante mezclas bacterianas

BIORREMEDIACIÓN DE METALES PESADOS MEDIANTE EL USO DE MEZCLAS BACTERIANAS.

Fabian Gomez Galvis cod: 1610551

Wendy……………………………..

La contaminación ambiental por metales pesados ​​y tóxicos debido a la minería, procesos metalúrgicos, y otras industrias químicas es un problema mundial que afecta tanto a la salud humana y el medio ambiente. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto sinérgico de las mezclas bacterianas en la biorremediación de una mezcla de Pb, Cd, Cu presentes en suelos contaminados. En comparación con el método de cultivo solo, las mezclas bacterianas mostraron una mayor tasa de crecimiento, la actividad de ureasa, y la resistencia a metales pesados. Cuatro cepas bacterianas fueron aisladas e identificadas Viridibacillus arenosi B21, Sporosarcina soli B-22, Enterobacter cloacae KJ-46, y E. cloacae KJ-47, que obtuvieron de una mina abandonada en Corea y mostró efectividad en la precipitación de la calcita inducida por microorganismos (MICP). Los siguientes parámetros se controlaron durante el transcurso del experimento: densidad óptica, pH, actividad de la ureasa, la producción de la calcita, la tolerancia a los metales pesados, y la prueba de impermeabilidad. Se observaron efectos sinérgicos sobre la remediación de diferentes metales pesados ​​a través de la modificación de las mezclas bacterianas y, después de 48 h, se registró la biorremediación de 98,3% para Pb, 85,4% para Cd, y 5,6% para Cu. En comparación con los cultivos de cepas individuales, las mezclas bacterianas demostraron una mayor resistencia y la eficiencia para la remediación de los metales pesados. Por lo tanto, nuestros resultados muestran que el uso de mezclas bacterianas es útil en la biorremediación de metales pesados ​​del medio ambiente contaminado.

INTRODUCCION

La acumulación de metales pesados en el agua, sedimentos y suelos ha dado lugar a graves problemas ambientales. En los últimos años, varios procesos han sido desarrollados con el objetivo de reducir o recuperación de metales pesados de ambientes contaminados (Akinciand Guven, 2011).  Aproximaciones físicas y químicas son capaces de eliminar un amplio espectro de contaminantes, pero las principales desventajas de estos métodos se encuentran en el aumento de consumo de energía y la necesidad de productos químicos adicionales (Ilhan et al., 2004). En los últimos años, los procesos tales como la biolixiviación, biosorción, y bioprecipitación todos se basan en el uso de microorganismos que tienen la capacidad de solubilizar, adsorber, o precipitar los metales pesados (Ballester Et al, 1992;.. Zouboulis et al, 1997). Hasta la fecha, la mayor parte de las investigaciones sobre la precipitacion de la calcita inducida por microorganismos (MICP) se ha limitado a las bacterias ureolíticas, con especial énfasis en la catálisis de la hidrólisis de la urea (Ferris et al., 2003), la eficiencia de la producción de calcita (Muynck et al, 2010;. Van Paassen et al., 2010), y la modificación de las propiedades físicas del suelo por bacterias modelo (Burbank et al, 2011;. De Jong et al., 2010). La MICP ha demostrado que aumenta la resistencia al corte de materiales porosos (De Jong et al, 2006;. Harkes et al., 2010). MICP surge de la siguiente reacción catalizada por la ureasa: (NH2)2CO + 2H2O → 2NH4++ CO32− se produce en presencia de iones calcio disueltos, lo que lleva a la precipitación de cristales de carbonato de calcio: Ca2++ CO32−→ CaCO3(s).

Los cristales formados por este proceso crean puentes entre partículas, mejorando así la resistencia y la rigidez del material (Harkes et al., 2010).  CaCO3 ureasa inducida puede llenar los espacios de poros dentro de las diversas matrices de suelo y granos de suelo de cemento para formar piedra arenisca (Burbank et al, 2011;.. Deepak et al, 2009;. De Jong et al, 2006). La precipitación de CaCO3 inducida por la hidrólisis catalizada por la ureasa de urea se ha demostrado que cambiar las propiedades de ingeniería de geomateriales (Burbank et al, 2011;. Whiffin et al., 2007). Sistemas de mezclas bacterianos han sido utilizados para estudiar las interacciones entre las poblaciones de células e interacciones fundamentales célula-célula. Recientemente, estos sistemas han sido de particular interés para los biólogos sintéticos y para el estudio y la ingeniería de sistemas sintéticos multicelulares complejos. En el nivel básico, un cocultivo isa cultivo de células de configuración, en la que dos o más poblaciones de células se cultivan con cierto grado de contacto entre ellos (Gore et al., 2014). El objetivo fundamental del sistema mezclas bacterianas es entregar beneficios sociales a través de sus aplicaciones industriales, médicas y ambientales (Chen, 2012; Kitney y Freemont, 2012).

Por lo tanto, muchos sistemas de mezclas bacterianas se desarrollan para futuras aplicaciones industriales, médicas o ambientales. Aunque las interacciones sinérgicas entre los metales y bacterias ureolíticas han atraído una parte justa de la atención, los efectos de ambientes contaminados por metal sobre el crecimiento de mezclas bacterianas son todavía desconocidos.

La utilización de microorganismos con probo el potencial de biorremediación y la supervivencia en el ambiente contaminado es crucial para una biorremediación con éxito. En vista de ello, el presente trabajo tiene como objetivo estudiar la capacidad de remediación de metales pesados mediante cultivos bacterianos puros y mixtos, para aplicaciones de proceso de biorremediación.

2. Materiales y métodos

  2.1. Microorganismos y condiciones de cultivo

Cuatro cepas bacterianas fueron aisladas del suelo de una mina abandonada en nuestros trabajos anteriores (Kang et al., 2015). Estas cepas incluyen Viridibacilo arenosi B-21 (B-21), Sporosarcinasoli B-22 (B-22), Enterobacter cloacae KJ-46 (KJ-46), y E. cloacae KJ-47 (KJ-47). Tres conjuntos de experimentos se llevaron a cabo en condiciones aeróbicas utilizando co-cultivo definido A1, cultivos bacterianos mezclados de B-21 y B22; A2, cultivos bacterianos mezclados de KJ-46 y KJ-47; A3, cultivos bacterianos mezclados de B-21, B-22, KJ-46, y KJ-47. Estas cepas fueron pre-seleccionadas en base a sus altos niveles de actividad de ureasa y producción de calcita. Además, estas cepas tienen la más alta tolerancia a metales pesados. Sus secuencias han sido depositados en GenBank con  los números de acceso KJ671467 (B-21), KJ485701 (B-22), KF598853 (KJ-46), y KF598854 (KJ-47). Las mezclas bacterianas se cultivaron de forma rutinaria en 30◦C en caldo YA (extracto de levadura a una concentración 20 g / L y sulfato de amonio a una concentración de 10 g / L a pH 7). El pH final del medio fue ajustado a 7,0.

7.0.2.2. Preparación de metales pesados solución madre.

Para la preparación de una concentración de 1 M de las mezclas de soluciones madre de metales pesados las cantidades necesarias de: CdCl2 · 5H2O (Kanto Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón.), PbCl2 (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón), y CaCl2 (Samchun Pure Chemical Co., Ltd., Corea) fueron disueltas en agua Milli-Q. Todas las soluciones se filtraron a través de un filtro de 0,22 micras (Pall Co., MI, EE.UU.). Las concentraciones de trabajo de mezcla de metales pesados se obtuvieron mediante diluciones seriadas. Las soluciones madre se almacenaron en la oscuridad a 4◦C.

2.3. Medición de la actividad de la ureasa y la producción de calcita.

Las condiciones experimentales fueron las mismas que para el crecimiento de las mezclas bacterianas descrito anteriormente. Para establecer las mezclas bacterianas, primero, se añadió un cultivo bacteriano a los matraces experimentales y se incubó a 30◦C durante 24 h con agitación continua a 200 rpm. Se determinó la actividad ureasa usando el ensayo de fenol-hipoclorito (Natarajan, 1995). Se añadió la suspensión bacteriana (250 μl) a 250 μl de tampón de fosfato de sodio 0,1 M que contiene 500μl de solución de urea a 3 M. La mezcla se incubó a 37◦C con intervalos de tiempo regulares. Posteriormente, 2 ml de solución de fenol nitroprusiato se añadio a una solución de  hipoclorito alcalino, luego, se incubaron a 50◦C durante 40 min. Después de la incubación, se midió la Absorbancia a 626 nm con cloruro de amonio (0-10µM) como un estándar. Una unidad de actividad de la ureasa se definió como la cantidad de enzima que cataliza la hidrólisis de 1 μM de urea por min.

Para producir calcita, los aislados se cultivaron en caldo de YA para 24 h y se subcultivaron en caldo de BPU (3 g de extracto / L de ternera, 5 g / L de peptona, y 20 g / L de urea a pH 7) a 30◦C durante 72 h con agitación continua a 200 rpm. Se añadió la suspensión bacteriana (500? L) a 500? L de una solución de dihidrato de cloruro de calcio a 350 mM y la mezcla se centrifugó a 16.179 × g durante 5 min a 25◦C para recoger el precipitado. Finalmente, el precipitado se secó a 50◦ C durante 48 h antes de ser pesado.

2.4. Determinación de la concentración mínima inhibitoria.

Los experimentos de tolerancia se llevaron a cabo en Erlenmeyers de 250 ml, que contienen cada uno 45 ml de caldo de YA. Aproximadamente el número igual de células de las cuatro cepas aisladas fueron  utilizadas y las mezclas bacterianas con una densidad celular inicial de 1x108 cell/ml para cada una de las cepas aisladas. Todos los cultivos fueron incubados en 30 ºC y agitación a 200 rpm. Para estudiar la influencia de los metales pesados en el crecimiento bacteriano, las mezclas bacterianas fueron expuestos a una mezcla de metales pesados con concentraciones individuales que van desde 0 a 10 mM.

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