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EXTRACCIÓN DE RNA DE PLEÓPODOS 22 - Julio - 2014

Inicialmente se tomó una muestra de pleópodos de 3 organismos con un peso neto de 53 mg.

* Las incubaciones deben de ser en un recipiente en hielo para evitar en lo mejor posible la degradacion del RNA

Se homogenizo el tejido con TRIzol (1 ml por cada 50 mg. de tejido) y se masero con la ayuda de pistilos estériles con rayos UV.

Después se dejó incubar por 5 minutos y se agregaron 200 μl de cloroformo por cada 1 μl

Posteriormente se agita suavemente de arriba a abajo (15 segundos)

Centrifugación a 12,000 rpm por 10 minutos a 4°C.

Se transfiere la fase acuosa a otro tubo estéril para realizar una segunda separación.

Repetir el punto número 1 hasta el 4. Se recolectó el sobrenadante para pasarlo a un tubo nuevo.

Agregamos 500 μl de isopropil (100 %) por cada 1 μl.

Se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos y se centrifuga a 12,000 rpm por 10 minutos a 4°C.

Después de la tercera centrifugación se recolectó el sobrenadante y se siguieron 2 rutas:

1) Proceso de lavado se agregó:

1 ml de etanol (75 %) por 1 ml de TRIzol y se pasó a centrifugar brevemente después se pasará a centrifugar a 7,400 rpm por 5 minutos a 4°C.

Se descarta el sobrenadante y se colocó el tubo boca abajo para secar el pellet (10 min.)

Por último se resuspende el pellet en 40 μl de agua Mili - Q y se incubó a 60 °C por 10 min. Almacenar a -80°C.

Una alternativa es omitir el proceso de lavado con etanol para reducir la pérdida de RNA, sin embargo se incrementa el riesgo de contaminación.

NOTA: Después de agregar el isopropanol se recomienda incubar a -80°C para incrementar la precipitación (10 min.)

OBSERVACIÓN: El pellet formado es blanquecino y pequeño y se encuentra adherido a la pared del tubo.

Cuantificación:

Muestras sin lavado.

2076.7

2.46

#1

2149.9

2.10

2047.1

2.42

1470.4

1.51

# 2

1522.8

1.64

1519.0

1.62

1994.0

2.44

# 3

1989.9

2.34

1996.2

2.39

760.8

1.89

# 4 (-80°C por 10 min.)

541.7

1.83

636.5

1.86

623.6

1.90

# 5

515.0

1.88

529.4

1.84

Promedio: 646.33 1.86

PURIFICACIÓN DE RNA CON DNasa I RECOMBINANTE 23 - Julio - 2014

Se tomó la muestra de RNA (# 4, 646.33 ng/ μl.) y se preparó la reacción con 6.4 μl. de la muestra de RNA (el equivalente a 10 μg.).

Además se agregaron 5 μl. de Buffer de incubación 10x, 1 μl. de DNasa I (Equivalente a 10 unidades) y se llegó a un volumen de 50 μl. con agua (37.6 μl.) después se incubó a temperatura ambiente por 20 minutos.

Al término de esta se agregaron 2 μl. de 0.2 molar de EDTA (pH 8.0).

Se realizó una segunda incubación a 75°C por 10 minutos y al finalizar se almacenó a - 80°C

Para corroborar la eficiencia de la digestión, una amplificación de PCR para el gen de Tripsina (Los primers fueron Try Ex)

La reacción a preparar fue la siguiente:

7.5 SYBR x 5 = 37.5 DNA

0.5 PF x 5 = 2.5 + 1 μl. de = RNA (H)

0.5 PR x 5 = 2.5 RNA (L)

4.5 de H2O x 5 = 22.5 H2O

13 μl de la Reacción para cada uno de los tubos

Condiciones del PCR

95°C 3 min.

95°C 0 min. 45 seg.

55°C 0 min. 45 seg.

72°C 0 min. 45 seg.

72°C 10 min.

Cuantificación de RNA 30 - 07 - 2014

Muestra/ Unidades

ng/μl

A260/A280

A260

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