CUESTIONARIO PREVIO Práctica 5. Electroforesis de DNA

CUESTIONARIO PREVIO

Práctica 5. Electroforesis de DNA.

1. ¿Qué es la agarosa?

La agarosa es un polímero lineal compuesto de residuos alternantes de D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa unidos por enlaces glucosídicos α(1 → 3) y β(1 → 4), que se extrae de las algas de los géneros Gellidium y Gracillaria. Las cadenas del polímero de agarosa forman fibras helicoidales, que al solidificar forma una malla tridimensional de canales con diámetros entre 50 y >200 nm. La agarosa es soluble en agua a temperaturas superiores a los 65 °C, dependiendo del grado de sustituciones hidroxietílicas de sus cadenas laterales. Dichas sustituciones se pueden modificar para provocar que la temperatura de gelificación varíe entre los 17 y 40 °C. La agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte y no tóxica que supone una herramienta indispensable en gran cantidad de técnicas de biología molecular, bioquímica y biología celular. Su uso más extendido es para construir geles que permitan separar moléculas de DNA mediante electroforesis, además de ser utilizada para fijar moléculas a su estructura como anticuerpos o antígenos. Igualmente se utiliza en cultivos celulares y en microbiología. Otros usos menos extendidos son la utilización de estos geles como matrices en la reparación de tejidos dañados.

1. ¿Qué ventajas tienen los geles de poliacrilamida respecto a los de agarosa?

Los geles de poliacrilamida, a pesar de tener una mayor limitación en cuanto al tamaño de los fragmentos que se pueden separar (5-600 pb), poseen un poder de resolución mucho mayor que los geles de agarosa, permitiendo la separación de moléculas que difieren en un sólo par de bases; igualmente, esta característica les otorga mayor eficiencia en la separación de proteínas. Sin embargo, los geles de poliacrilamida presentan también diversas desventajas respecto a los geles de agarosa, pues son tóxicos y presentan mayor dificultad en su elaboración y manipulación, por ello, el método estándar para la separación y purificación de DNA cuando no se requiere un alto poder de resolución es la electroforesis en gel de agarosa.

1. ¿Para qué propósito se utiliza una electroforesis en gel de poliacrilamida?

Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas, dado que reúnen una serie de propiedades idóneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos. Los geles de poliacrilamida se utilizan cuando se requiere un alto poder de resolución y cuando la cantidad de muestra es grande, pues la poliacrilamida permite cargar una mayor cantidad de DNA que la agarosa. La poliacrilamida se utiliza además siempre y cuando el tamaño del DNA a separar sea menor de 500-600 pb.

1. ¿Para qué sirve el buffer de carga?

El buffer de carga debe tener una alta densidad que permita que la muestra se introduzca en el pocillo del gel, además de colorantes que nos indiquen cuando debe detenerse la electroforesis. Lo anterior significa que el buffer de carga le confiere peso a la muestra para que llegue al fondo de los pozos además de indicar el corrimiento de la misma mediante el colorante.

1. Diferencias y aplicaciones entre el uso del TAE y TBE.

Como buffer de electroforesis y para la preparación del gel puede utilizarse opcionalmente TAE (Tris-Acetato EDTA) o TBE (Tris-Borato EDTA). El TAE tiene una menor capacidad de amortiguación que el TBE, y puede resultar en una acidificación del medio si la electroforesis se desarrolla durante un período muy prolongado, pero funciona muy bien con tiempos normales de electroforesis, además tienen una mayor capacidad de resolución que el TBE para tamaños grandes de DNA. El uso de TAE ha sido también descrito en el análisis de mutación de grado amplio por métodos electroforéticos. En comparación con TBE, TAE ofrece ventajas en tratamientos enzimáticos posteriores de la muestra de DNA. Ambos suelen prepararse como soluciones concentradas, que pueden almacenarse a temperatura ambiente (previa esterilización en autoclave), estas se diluyen con agua antes de cada electroforesis para lograr la concentración de uso: 1x para el TAE y 0.5x para el TBE.

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