Caracterización de una proteína que interviene en la formación de agregados en células ganglionares de nervio óptico

Caracterización de una proteína que interviene en la formación de agregados en células ganglionares de nervio óptico.

RESUMEN

En el presente trabajo se dedicó a caracterizar una proteína que se ha encontrado forma aglomerados en las células ganglionares, dado que no se tiene conocimiento de su secuencia y posibles formas de interacción, proponemos en el siguiente estudio una manera de aislar el péptido en base de los aglomerados, para proseguir con un modelo de su estructura. Dado que las células ganglionares y las células de schawnn son pertenecientes a la familia de células gliares proponemos que el método de interacciones muy similar, para la formación de agregados. Al analizar los resultados de RMN nos pudimos dar cuenta que en efecto el peptido guarda una muy estrecha relación con el peptido beta perodado que los agregados son de menor tamaño

INTRODUCCIÓN

Las proteínas macromoléculas formadas por la asociación de aminoácidos que adquieres cierta estructura nativa que ayuda en su función.

Los cambios conformacionales asociados a la función de una proteína la pueden llevar a un estado disfuncional, como puede ser la formación de agregados. Esta pérdida de plegamiento conduce a dos principales formas de agregados, fibrillas amiloides y agregados amorfos. Enfermedades que acosan a la sociedad en la actualidad como el Alzheimer asociada con las fibrillas amiloides, compuestas de estructuras β-cruzadas, paralelas a un eje, altamente ordenadas. Los agregados amorfos, que incluyen varios tipos de asociaciones sin orden a largo alcance, también son asociados a enfermedades como en pacientes con cataratas que muestran agregados.

Recientes estudios han mostrado que en pacientes con cataratas muestran alteraciones en el nervio óptico, nuestra propuesta es identificar si existe alguna acumulación de proteínas como en el caso de las células schawnn donde se forman los β-amiloides, ya que ambas células son células de la glía (figura 1A, 1B).

[pic 1]

Nervio óptico. A) Visualización del nervio óptico en donde se ha visualizado cambios en la morfología del mismo en

pacientes con cataratas B) Células ganglionares  de nervio óptico

HIPÓTESIS

Establecer una relación estructura función en la formación de agregados en células ganglionares de nervio óptico con los agregados formados en células del sistema nervioso, proponemos un protocolo de aislamiento y que la estructura es muy similar a las fibrillas amiloides.

OBJETIVOS

Establecer cada uno de los pasos en el protocolo para la obtención de agregados en nervio óptico y ampliar el conocimiento en la estructura  de los agregados.

En caso de existir múltiples proteínas implicadas en los agregados tratar de modelar un posible mecanismo de interacción.

MATERIALES Y METODOS

Modelo murino con cataratas y sanos. Se utilizaron 30 ejemplares con cataratas para determinar cambios en el nervio óptico así como para posteriormente aislar los agregados de proteína desconocida  y 5 modelos sanos como control para verificar las alteraciones en el nervio óptico.

Disección de tejido y obtención de muestra

Cromatografía de filtración en gel  las muestras murinas,  mediante cromatografía en  filtración de gel se obtuvieron las proteínas de mayor peso molecular, para eso se usaron diminutas partículas porosas de polisacáridos con puentes cruzados de dextrano, ya que a medida que van descendiendo por la columna, las moléculas suficientemente pequeñas que penetran en los poros se retrasan en el interior de las partículas mientras nuestras partículas más grandes eluyen con más rapidez.

Gel de poliacrilamida con SDS-page Las muestras se colocaron en una solución que contiene dodecil sulfato sódico para desplegar a nuestra proteína liberándola de sus asociaciones con alguna otra molécula proteica o lipídica, además se añadió β-mercaptoetanol para romper los enlaces S-S que pudieran existir en las proteínas de forma que se puedan analizar separadamente todos los polipéptidos  

Espectrometría de masas MALDI-TOF MS/MS   Separa los iones en base a su masa y carga, realizamos cortes de péptidos mezclados con un ácido orgánico y secado sobre una lámina de metal después la muestra fue volatilizada con un láser  con lo que los péptidos se desprendieron de la lámina en forma de gas ionizado, estos son acelerados en un campo eléctrico y vuelan hacia el detector el tiempo que depende de su masa y carga

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