Clonacion Molecular

MÉTODOS GENERALES DE CLONACIÓN MOLECULAR

PRINCIPIOS DE CLONACIÓN MOLECULAR

La denominación "ADN recombinante" se refiere a combinaciones muevas de ADN creadas entre secuencias o fragmentos de esta molécula (los cuales son de interés por alguna razón) y moléculas de ADN bacteriano capaces de duplicarse indefinidamente en el laboratorio (Freifelder, 1983). En este proceso, primero se obtiene un fragmento del ADN de interés denominado inserto, el cual se une a otra molécula de ADN (generalmente de mayor tamaño) llamado vector. Posteriormente se lleva a cabo el proceso de clonación molecular en sí, en el cual se introduce el ADN recombinante en una célula receptora y esta finalmente al multiplicarse da lugar a nuevas células con similares características a ella; obteniéndose de esta manera lo que se denomina un clon. Por consiguiente un clon no es más que un grupo grande de células, moléculas de ADN o bacterias que surge de una célula o molécula ancestral y son idénticas a esta; y clonación es el proceso que le da origen (Granner, 1992; Plata 1996).

Las células receptoras del ADN híbrido pueden ser tanto procariotas como eucariotas y el proceso de introducción del mismo se denomina transformación para las primeras y transfección para las segundas (Cerezo, 1995).

Para llevar a cabo la clonación molecular se requiere lo siguiente:

a) Una fuente adecuada de ADN: Las fuentes más importantes de ADN para clonación son el ADN genómico (cromosómico) que contiene los genes completos y lo que se conoce como ADN complementario (ADNc) que se obtiene a partir del ARN mensajero (ARNm) bajo la acción de la enzima transcriptasa reversa o transcriptasa inversa. Esta enzima es capaz de sintetizar ADN a partir del ARN el cual le sirve como molde. El empleo de una u otra fuente depende de los objetivos que se persigan con el estudio a realizar.

b) Vectores de clonación (ADN recombinante): Un vector de clonación es una molécula pequeña de ADN que puede replicarse de manera autónoma en un huésped (células bacterianas o de levaduras), a partir de las cuales es posible aislarlo en forma pura para el análisis. Los vectores se utilizan para clonación porque pueden seguir su desarrollo normal a pesar de que secuencias adicionales de ADN sean incorporadas en su material genético; se auto replican utilizando la maquinaria enzimática de la célula huésped, y en este proceso, no se mezclan con el ADN genómico de la célula (Plata, 1996).

Debido a que los vectores de clonación pueden generar un gran número de copias por célula, ya que los huéspedes bacterianos o de levaduras pueden crecer indefinidamente en el laboratorio, es posible obtener grandes cantidades de secuencias del ADN de interés. Cierto número de vectores se utiliza de modo común para este propósito, cada uno con ventajas y limitaciones y dentro de ellos tenemos:

Plásmidos: Son moléculas circulares de ADN de doble cadena que se replican de modo extracromosómico en bacterias, o menos comúnmente en levaduras (Lehninger, 1993; Ministerio de Educación, 1981). En ellos se encuentran genes que le confieren al organismo que los posee resistencia a algunos antibióticos, así como genes involucrados en la producción de toxinas y la degradación de productos naturales (Stryer, 1995).

Bacteriófagos: Son virus que infectan a las bacterias y están constituidos, según su clase, por un núcleo de ADN o ARN y una cubierta proteica; algunos presentan una cola, y son incapaces de replicarse autónomamente por lo que necesitan infectar a la célula para poder hacerlo. Dentro de los fagos más utilizados como vehículos moleculares de clonación, se encuentran el lambda y sus derivados.

Cósmidos: Son básicamente plásmidos que emplean la habilidad de las partículas infecciosas del bacteriófago l para "empaquetar" de manera eficiente grandes piezas lineales de ADN e introducirlas en las células bacterianas. Estos vectores se reproducen de igual manera que los plásmidos en las bacterias (Granner, 1992; Lehninger, 1993).

"Cromosomas artificiales" de levadura: Además de los vectores anteriormente mencionados, existe otro tipo que permite clonar hebras de ADN de gran tamaño y que se conocen como cromosomas artificiales de levadura (YAC, del inglés yeast artificial chromosome). Este tipo de vector es capaz de replicarse en el huésped Saccharomyces cerevisiae y tiene

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