Condrocitos

Siguiendo el protocolo “ A practical way to prepare primer human chondrocyte culture”

REACTIVOS Y MATERIALES

• Medio RPMI
• Medio DMEM
• 6 tubos eppendorf
• Pipetor
• Pipetas de 5 y 10 ml
• Tubos falcon
• PBS
• Collagenasa tipo II
• Cajas de 6 pozos
• Flasks

PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS

RPMI

• 50  de anfotericina B[pic 1]
• 500  de L-glutamina[pic 2]
• 500  de penicilina/streptomicina[pic 3]
• 5 ml de FBS
• 45 ml de medio RPMI

DMEM

• - 50  de anfotericina B[pic 4]
• 500  de L-glutamina[pic 5]
• 500  de penicilina/streptomicina[pic 6]
• 5 ml de FBS
• 45 ml de medio RPMI

PROCEDIMIENTO

Antes de la biopsia del conejo, se pusieron 4 ml de medio DMEM en 3 tubos eppendorf y en otros 3 tubos eppendorf se pusieron otros 4 ml de medio RPMI.

----BIOPSIA DE CONEJO-----

1. Se pusieron .81 de zelozol al conejo, para adormecerlo, se espero unos minutos para que hiciera efecto y se checaron sus reflejos
2. Se pusieron otros .81 de zelazol para asegurarnos de que estuviera dormido.
3. Una vez que el conejo estaba dormido, se puso 3 ml de pisabental al corazón.
4. Cuando el conejo ya no muestra respuesta a estímulos, se limpia el área donde se va a hacer la biopsia con isodine.
5. Se hace una inserción lateral y se va quitando todo lo que no sea necesario (ligamento, músculo)
6. Una vez que se llega al cartílago, se empieza a cortar en pequeños pedazos
7. Estos pedazos de cartílago se van poniendo en los tubos eppendorf que ya tienen medio (los que se prepararon antes de la biopsia)
8. Una vez que todos los tubos eppendorf tienen cartílago, estos se transportan al laboratorio
9. Los pedazos de cartílago los vas a sacar uno por uno y los vas a macerar y esto los vas a pasar a tubos falcon de 15 ml.
10. Cuando ya todos los pedazos están macerados, se les agregó 2 ml del medio que les correspondía.
11. Se centrifugaron por 10 min a 1200 rpm
12. Al terminar de centrifugar, el sobrenadante se deshecha y te quedas solo con el pellet.
13. En una caja de 6 pozos se puso 2 ml de medio y 2 ml de enzima collagenasa tipo II.
14. Se añadieron los pellets a los pozos
15. Esa caja se dejo en una incubadora por 16 hrs.
16. Pasadas las 16 hrs, se saca la caja de la incubadora
17. El tejido y el medio que se encontraba en los pozos fue pasado a tubos falcon de 15 ml para volver a centrifugar.
18. Se centrifuga de nueva a 1200 rpm por 10 min
19. Se descarta el sobrenadante de nuevo y te quedas solo con el pellet.
20. El pellet es resuspendido con el medio correspondiente
21. Despues estos pellet fueron pasados a dos cajas de 6 pozos, estas cajas contenían gelatina (las cajas con gelatina fueron previamente lavados con PBS ya que la gelatina es tóxica para las células, el lavado fuer realizado 2 veces)
22. Se añadió 3 ml de medio para pasar los pellets a las cajas
23. Al final de sembrar todas las cajas, se les agregó 1 ml más de medio a cada pozo.  [pic 7][pic 8][pic 9][pic 10][pic 11][pic 12][pic 13][pic 14][pic 15][pic 16][pic 17][pic 18][pic 19]

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