Control de exactitud de longitud de onda.

La mayoría de los análisis cuantitativos en laboratorios clínicos se hacen con algún tipo de instrumento. El espectrofotómetro constituye una herramienta fundamental dentro de un laboratorio clínico. El correcto desempeño de los espectrofotómetros es entonces determinante, en última instancia, de la calidad analítica de los resultados que emite el laboratorio.

La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y se basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un compuesto y su concentración. Cuando se hace incidir luz monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido.

[pic 1]

Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, es decir, a una determinada longitud de onda de la energía radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto.

La mayoría de los instrumentos espectroscópicos, como el espectrofotómetro, están constituidos por: una lámpara o fuente luminosa, que proporciona energía en forma de REM, una rendija de entrada que nos permite enfocar la luz, un selector de longitud de onda que puede ser un monocromador como un prisma, una rendija de salida para enfocar la luz, un contenedor de cubetas, en donde se deposita el contenedor con la solución a analizar y un detector de energía radiante, que detecta la energía no absorbida por la muestra.

[pic 2]

De acuerdo con ley de Lambert beer, la concentración de una sustancia es inversamente proporcional al logaritmo de la luz transmitida o directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida. Es por esto que su expresión matemática es la siguiente:

 A= εbc= 2- log %T  Donde A es absorbancia, “ε” es absortividad o coeficiente de extinción, “b” es longitud de paso de luz en centímetros, “c” es concentración y %T es el tanto por ciento de tramitancia.

La ley de lamber beer es la ley fundamental que relaciona la concentración de una molécula en disolución  con su capacidad de absorción, y es el resultado de la combinación de otras dos leyes: La ley de Lamber Bouguer y la Ley de Beer.

La ley de Lamber Bouguer establece que cuando pasa luz monocromática por un medio homogéneo, la disminución de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional al espesor del medio, lo que equivale a decir que la intensidad de la luz  transmitida disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente el espesor del medio absorbente.

La ley de establece que la intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente la concentración de la sustancia absorbente, cuando este haz para a través de un medio homogéneo. La ley de Lambert-Beer relaciona ambas conclusiones en una fórmula para determinar la absorbancia.  A= ƐlC

El objetivo de esto consiste en que el bioquímico cuente con los materiales necesarios para la evaluación del funcionamiento del espectrofotómetro, y de esta manera, pueda verificar si los parámetros fotométricos se encuentran dentro de los  rangos de aceptabilidad establecidos de acuerdo a las normativas internacionales. Se deberán llevar registros que certifiquen  dichos controles. Los estándares de calidad del instrumental deberán cumplirse y por el contrario si algún parámetro estuviera fuera de rango, es conveniente realizar la reparación del instrumento a través de un servicio técnico acreditado y luego volver a verificar el buen funcionamiento.

Uno de los controles que se les realiza a estos equipos es el control de la exactitud de la longitud de onda, el cual mide el grado de concordancia entre la longitud de onda que indica el seleccionador y la longitud de onda de referencia requerida.

El fundamento de este control se basa en utilizar  el método del punto isosbéstico: El dicromato de potasio, tiene la particularidad que los espectros de las formas ácidas y básica del colorante en igual concentración presentan la misma  a una longitud de onda determinada “punto isosbéstico”. Esta longitud de onda es independiente de la concentración del colorante y de la temperatura de trabajo por lo cual resulta un parámetro fijo de referencia. Si el punto isosbéstico hallado experimentalmente difiere del teórico, indica que existe un corrimiento en la longitud de onda.

Para realizar este control necesitamos de los siguientes reactivos:

-Dicromato de potasio 29.5 mg/L

-NaOH 0,1 N

-H2SO4 0,1 N

El procedimiento para este control consta de tres pasos básicos:

• Preparación de las formas   ácida y  básica del colorante.
• Realización del espectro de barrido.
• Interpretación de resultados: Gráfico del espectro para hallar el punto isosbéstico.

La realización de las formas ácida y básica del colorante se prepara cumpliendo el siguiente protocolo:

La realización del espectro de barrido se realizará llevando la absorbancia a “cero” a 400 nm con una cubeta blanco de agua destilada y luego midiendo las absorbancias de las soluciones ácida y básica a 400 nm. Repetir este procedimiento hasta 500 nm de 5 en 5 nm (400, 405, 410,415 nm….500nm) llevando siempre la absorbancia a cero para blanquear.

...