Cromatografía preparativa

Cromatografía preparativa

La cromatografía preparativa comprende un amplio campo de aplicaciones, desde el aislamiento de 1 µg. de muestra para identificación espectroscópica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g. La cromatografía preparativa se diferencia de la técnica básica en muchos aspectos, desde la preparación de la papilla. Ésta debe hacerse con menos agua que de ordinario. Una papilla más espesa ayuda a estabilizar el grosor de las placas que se precisa para una carga de mayor magnitud. El espesor óptimo oscila desde un mínimo de 1 mm. hasta un máximo de 2 mm.

Las placas utilizadas en cromatografía preparativa son placas grandes, de aproximadamente 20x20 cm. que permiten separar aproximadamente 1 g. de mezcla utilizando unos 35 g. de adsorbente.

La siembra de la muestra se realiza mediante la ayuda de una jeringuilla o tubo capilar. La siembra se realiza a lo largo de una línea recta (existen en el mercado diverso utensilios para evitar torcerse). Si al terminar la primera siembra todavía queda muestra, se seca la primera siembra y se aplica la segunda, intentando que ésta quede sobre la anterior, para así conseguir que el frente sea lo más estrecho posible. La siembra debe realizarse a lo ancho de la placa.

Una vez sembrada la muestra se desarrolla la cromatografía. Se utiliza un adsorbente con indicardor fluorescente para ver en la lápmpara ultravioleta donde han quedado las manchas de los diferentes compuestos, dichas manchas se marcan.

Una vez localizados los compuestos, éstos se extraen de la fase estacionaria, uno a uno, con la ayuda de una espátula, sobre un papel de filtro u otro soporte. Posteriormente se coloca cada componente en un erlenmeyer, y se mezcla con un disolvente (metanol). Una vez disuelto el compuesto se filtra varias veces para separar el compuesto y la fase estacionaria. Una vez separado se elimina el disolvente (destilación), con lo cual se obtiene el componente separado.

Si no se dispone de indicador fluorescente, no se pueden usar reveladores químicos sobre toda la placa. El proceso a seguir es el siguiente: se raya la placa separando totalmente una pequeña franja de placa, sobre la cual se aplica el revelador químico, y a partir de esta franja se marcan las franjas de compuestos.

Cromatografía en columna

La cromatografía en columna es quizás el método más general, utilizado para la separación, a la vez que para la purificación, de diferentes compuestos orgánicos que se encuentren en estado sólido o líquido

En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria utilizada, es decir, el absorbente, se coloca en el interior de una columna de vidrio, la cual finaliza con una llave para controlar el paso de sustancias al exterior de la columna. La fase estacionaria se impregna con el eluyente o fase móvil. Seguidamente la mezcla orgánica que nos interesa separar la depositamos por la parte superior de la fase estacionaria, y así la fase móvil podrá ir atravesando el sistema.

Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase móvil, poco a poco saldrán de la columna cromatográfica, y se recogen en fracciones. Las fracciones menos polares, que son por lo general las que se retienen poco o nada en el absorbente, serán las primeras en salir de la columna. En cambio, las sustancias más polares, quedan retenidas por más tiempo en el absorbente, y a menudo es necesario el uso de diferentes disolventes con la finalidad de incrementar su polaridad para que sean arrastradas por estos.

El tiempo que se necesita para hacer fluir un compuesto por la columna, se conoce con el nombre de tiempo de retención. Este tiempo varía, siendo característico de cada compuesto en una condiciones cromatográficas determinadas, que varían según el absorbente usado, el disolvente, la presión, el diámetro que tenga la columna utilizada, etc.

El absorbente mayormente utilizado para las cromatografías en columna, es el gel de sílice. A veces, en sustitución del gel de sílice, cuando éste es incompatible con la mezcla a cromatografiar, se utilizan la alúmina o el florisil (silicato magnésico). La cromatografía en columna puede realizarse por gravedad o a media presión. Cuando se realiza a media presión, se conecta la cabeza de la columna a un compresor o a una línea de aire comprimido.

La medida de las partículas de gel de sílice para realizar las cromatografías a media presión debe ser más pequeñas que en el caso de la cromatografía por gravedad. Si en la cromatografía por gravedad utilizásemos un gel de sílice con un tamaño de partículas más pequeñas, no se produciría elución, pues se impediría el flujo del disolvente. Pero en cambio, si aplicamos presión, entonces debido a la fuerza si se produciría la elución por el disolvente.

A causa de la disminución del tamaño de las partículas del absorbente, se produce una separación más eficaz. Generalmente la cromatografía a media presión, produce mejores resultados que la cromatografía por gravedad, y además, al ser más rápida, es la más utilizada.

Cuando vamos a realizar una cromatografía en columna, lo primero que debemos hacer es elegir un disolvente adaptado para nuestro caso, para así optimizar la separación de los componentes de la mezcla. Dicha operación se produce a través de cromatografía analítica en capa fina. La variante más influyente en la eficacia de la separación de la cromatografía a media presión usando gel de sílice es el diámetro de la columna, así como la cantidad de gel utilizado.

Para elegir el disolvente, primero se lleva a cabo una cromatografía en capa fina de la muestra a analizar. El disolvente debe producir una buena separación de los componentes de la mezcla en la placa, colocando el componente menos polar a un Rf cercano a 0.3. En el caso de columnas pequeñas, lo ideal es usar un eluyente menos polar que el conseguido en el resultado de la cromatografía en placa.

A veces se utilizan mezclas de disolventes y se hace una elución en gradiente. Para esto, la cromatografía se inicia con una mezcla de disolventes de polaridad adecuada para poder separar el componente que posea mayor Rf, y así, una vez recogido, se aumentará poco a poco la polaridad para poder ir separando los componentes más polares. Si cuando se empieza la cromatografía se usa un disolvente excesivamente polar, los componentes de la mezcla eluirán conjuntamente, lo que llevaría a que la separación no tenga lugar. Una de las mezclas de disolventes más utilizadas es hexano/acetato de etilo.

Cromatografía En Papel

La cromatografía en papel se utiliza para compuestos muy polares o polifuncionales. El uso más común es para azúcares, aminoácidos y pigmentos naturales. En esta cromatografía se utiliza el fenómeno de

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