Cuantificación de proteínas
Enviado por Doryan94 • 28 de Mayo de 2019 • Práctica o problema • 600 Palabras (3 Páginas) • 141 Visitas
[pic 1]
[pic 2][pic 3][pic 4]
[pic 5]
[pic 6]
[pic 7]
Introducción
La ecuación de Michaelis y Menten explica la relación observada entre la velocidad inicial y la concentración inicial de sustrato Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas:
En la primera etapa se forma el complejo enzima sustrato.
En la segunda etapa, el complejo enzima- sustrato da lugar a la formación del producto, liberando la enzima libre: [pic 8][pic 9]
[E]+[S] [ES] [E]+[P][pic 10][pic 11][pic 12][pic 13]
Este modelo sólo es válido cuando la concentración del sustrato es mayor que la concentración de la enzima, y para condiciones de estado estacionario, es decir, cuando la concentración del complejo enzima-sustrato es constante, la reacción enzimática es irreversible, y que el producto no se liga con la enzima después de la reacción.
Esta consideración conduce a la expresión de velocidad:
[pic 14]
[pic 15]
En donde:
Vmax es la velocidad máxima
Km es la constante de Michaelis y Menten= [pic 16]
[S] es la concentración de sustrato
Objetivo
- Determinar los parámetros cinéticos (Km y Vmax ) de una reacción enzimática utilizando el programa Enzymelab y compáralos con los métodos de regresión lineal Lineaweaver –Burk y Hanes –Woolf
Procedimiento
[pic 17][pic 18]
[pic 19][pic 20][pic 21]
[pic 22]
[pic 23]
[pic 24]
[pic 25]
[pic 26][pic 27]
[pic 28]
Resultados
Método sin regresión lineal
Utilizando el programa de Enzymelab se determinaron los parámetros cinéticos Km y Vmax con regresión no lineal de la enzima Proteasa
Datos
Enzima | Proteasa |
Concentración | 2.812 mg/ml |
Actividad Especifica | 0.08 mmol prod/mg E*min |
pH | 7 |
S | 20mM |
[pic 29]
[S] (mM) | V(μM/min) |
20 | 4.2409 |
20 | 4.4127 |
20 | 4.7023 |
20 | 4.5775 |
20 | 4.6172 |
- Análisis de precisión
- Datos para obtener valores Km y Vmax
S(mM) | V(μM) |
10 | 4.1892 |
10 | 4.2149 |
5 | 4.21 |
5 | 4.4105 |
1 | 2.9022 |
1 | 3.025 |
0.5 | 2.1326 |
0.5 | 2.2999 |
0.1 | 0.7962 |
0.1 | 0.7491 |
0.08 | 0.6194 |
0.08 | 0.6322 |
0.05 | 0.4066 |
0.05 | 0.4056 |
[pic 30]
Con el programa de regresión no lineal se obtienen los siguientes parámetros cinéticos:
Km (mM) = 0.05073+/- 0.034
Vmax (μM/min) = 4.5647 +/-0.1615
Método con regresión lineal
- Método de Lineaweaver –Burk y Hanes –Woolf
Lineweaver-Burk | Hanes-Woolf | |||||
S(mM) | S(μM) | V(μM) | 1/S | 1/V | S | S/V |
10 | 1000 | 4.1892 | 0.001 | 0.2387 | 1000 | 238.7091 |
10 | 1000 | 4.2149 | 0.001 | 0.2373 | 1000 | 237.2536 |
5 | 500 | 4.21 | 0.002 | 0.2375 | 500 | 118.7648 |
5 | 500 | 4.4105 | 0.002 | 0.2267 | 500 | 113.3658 |
1 | 100 | 2.9022 | 0.01 | 0.3446 | 100 | 34.4566 |
1 | 100 | 3.025 | 0.01 | 0.3306 | 100 | 33.0579 |
0.5 | 50 | 2.1326 | 0.02 | 0.4689 | 50 | 23.4456 |
0.5 | 50 | 2.2999 | 0.02 | 0.4348 | 50 | 21.7401 |
0.1 | 10 | 0.7962 | 0.1 | 1.2560 | 10 | 12.5597 |
0.1 | 10 | 0.7491 | 0.1 | 1.3349 | 10 | 13.3494 |
0.08 | 8 | 0.6194 | 0.125 | 1.6145 | 8 | 12.9157 |
0.08 | 8 | 0.6322 | 0.125 | 1.5818 | 8 | 12.6542 |
0.05 | 5 | 0.4066 | 0.2 | 2.4594 | 5 | 12.2971 |
0.05 | 5 | 0.4056 | 0.2 | 2.4655 | 5 | 12.3274 |
Vmax=1/b | Km=Vmax*b | |||||
Km =Vmax*m | Vmax=1/m | |||||
[pic 31]
...