DETERMINACIÓN DE LAS CONSTANTES CINÉTICAS Y DE INHIBICIÓN PARA UNA ENZIMA

INFORME DE LABORATORIO No 4

DETERMINACIÓN DE LAS CONSTANTES CINÉTICAS Y DE INHIBICIÓN PARA UNA ENZIMA

Sergio Daniel Rodríguez

Sebastián Flórez

RESUMEN

El objetivo del laboratorio No 4 era determinar las constantes cinéticas (vmax y Km) de la enzima tirosinasa, a partir de los datos de absorbancia obtenidos en el laboratorio. En el laboratorio se utilizó la manzana como material de prueba. Se pesaron entre 10 a 15 gramos de esta, las cuales se llevaron a un mortero y se le agrego 30 ml de solución buffer a pH 6 y arena lavada. Después se trituro hasta que pareciera una compota, se llevó a centrifugar a 2000 rpm y luego se filtró. El sobrenadante fue usado para las pruebas (extracto enzimático). Luego se realizó un ensayo preliminar en una solución con agua y otra con catecol, la cual dio positiva para la solución que contenía catecol. Luego se pipetearon 6 tubos de ensayo, los cuales contenían diferentes volúmenes del extracto enzimático, buffer pH 7.2, agua (menos el tubo 5) y catecol (menos el blanco). Los tubos fueron llevados al espectrofotómetro; la absorbancia fue medida a una longitud de onda de 420 nm. A mayor concentración del sustrato mayor es la absorbancia.

Palabras claves: Tirosinasa, extracto enzimático, constantes cinéticas, Velocidad máxima, Km.

INTRODUCCION

La tirosinasa es una enzima que cataliza la oxidación de o-difenoles a O-QUINONAS, por lo que es una oxidorreductasa. Su E.C 1.14.18.1.

1: Oxidorreductasa

1.14: Actúa sobre pares donores con incorporación de oxigeno molecular

1.14.18: Con otro compuesto como uno de los donantes, y la incorporación de un átomo de oxígeno en el otro donante

1.14.18.1: Tirosinasa1.

Por lo general su sustrato es el catecol, ya que es un o-difenol.

Imagen tomada: Wiki Inc. (Modificada por última vez el 9 de abril de 2013). http://es.wikipedia.org/wiki/Catecol. Catecol.

Los procesos de síntesis realizados en las células, son en gran parte dados por la acción de las enzimas, las cuales son de naturaleza proteica. Son moléculas nitrogenadas que también dan a la célula energía, desintoxican compuesto, entre otras funciones. Cada enzima tiene un sitio activo, por el cual se unen al sustrato. Este sitio activo posee cierta afinidad por un sustrato, lo que se conoce como especificidad por el sustrato2. Esta especificidad por el sustrato es debida a la estructura molecular del sustrato.

La velocidad de la reacción catalizada por una enzima, se puede determinar mediante la utilización de determinadas concentraciones del sustrato. La velocidad de reacción desciende con el tiempo, debido a que no hay más sustrato para reaccionar en el sitio activo.

La velocidad de reacción puede descender debido a :

Si no hay sustrato en exceso, la concentración bajara durante la reacción, causando la baja de la velocidad.

La actividad de la enzima decae con el tiempo

El producto de la reacción puede inhibir la actividad de la enzima.

Para medir la actividad catalítica de un extracto enzimático, es necesario determinar la velocidad inicial de la reacción, que se puede medir en intervalos de tiempo midiendo la absorbancia, con la siguiente ecuación3.

V=(Af-Ai)/∆t

Las condiciones deben ser las óptimas para la reacción, esto quiere decir el pH que en este caso es entre 5 y 7, y la temperatura que en este caso seria 37°C5.

MATERIALES Y METODOS

Extracción de la enzima

Se pesó entre 10 a 15 gramos de la manzana (material de prueba) sin la cascara, en la balanza. Luego se llevaron al mortero, donde se mezclaron con 30 ml de buffer pH 7.2, y un poco de arena. La mezcla fue triturada con el pistilo. La mezcla fue llevada aun tubo de centrifuga y posteriormente se centrifugo por 5 minutos. Se filtró con papel filtro, y el sobrenadante fue llevado a un baño con hielo. Este es el extracto enzimático.

Ensayo enzimático

En dos tubos de ensayo se agregó 1 ml de extracto enzimático y 1 ml de buffer pH6. Al tubo se le adiciono 1 ml de agua y se verifico los cambios durante 3 minutos. El procedimiento se realizó en el tubo 2 reemplazando el agua por 1 ml de catecol.

Ensayo enzimático espectrofotométrico

Se rotulan 6 tubos de ensayo y se pipetea de acuerdo a la tabla.

Reactivos

ml Tubos

blanco 1 2 3 4 5

Extracto enzimático 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Buffer 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Agua destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -

catecol - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Tabla 1: Alícuotas de cada componente. Tabla tomada de la guía de laboratorio

Se agita cada tubo y se le lee la absorbancia a cada tubo a una longitud de onda de 420nm, con un intervalo de 33 segundos en cada medición.

RESULTADOS

Ensayo enzimático preliminar

TUBO Observaciones

Con agua No presento cambio de coloración durante los 3 minutos.

Con Catecol Presento un cambio de coloración durante los 3 minutos un amarillo intenso.

La prueba resulto positiva al tubo con catecol, debido a la oxidación del catecol (o-difenol) a o-quinona,

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