Datos SepsiTest PRUEBA DE DETECCIÓN DE SEPSIS POR PCR E IDENTIFICACIÓN DE PATOGENOS POR SECUENCIACIÓN

PRUEBA DE DETECCIÓN DE SEPSIS POR PCR E IDENTIFICACIÓN DE PATOGENOS POR SECUENCIACIÓN

“SepsiTestMolzym”

Muestra.

Muestra de pacientes con sospecha de Sepsis. Toma de muestra de sangre con Vacutainer en tubo Lila con EDTA.

Equipo e Instrumentos.

• Equipo automatizado de ácidos nucleicos MAXWell 16 AS2000Promega.
• TermocicladorGeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems (AB).
• Secuenciador 3130xl GeneticAnalyzer (AB).
• Campana de Bioseguridad.
• TermomixerR MTP Eppendorf.
• Cámara de Electroforesis E-Ge liBasePowerSystem y SafeImager Invitrogen.
• Centrifuga de Placas.
• Centrifuga de tubo Eppendorf.
• Vortex.
• Pipetas automáticas de 10; 20, 200; 1000 µL.
• Campana de bioseguridad.

Reactivo.

• Kit de extracción de ácidos nucleicos a partir de sangre total AS1010. Promega.
• Kit de PCR de Molzym.
• Kit de secuenciación de Molzym        
• Kit Big Dye Terminator V. 3.1 (AB)).
• Big Dye Exterminator Purification (AB).
• FG, 3130 Pop-7 TM Polymer (AB).
• Buffer con EDTA 10x concentrado (AB).
• Kit PureLInk PCR Purification Invitrogen.
• E-Gel doble columna con Bromuro de Etidio (BrEt) Invitrogen.
• Agua Grado Molecular.
• Alcohol Etílico desnaturalizado 96%.
• 2-Isopropanol.

Consumibles.

• Guantes de Nitrilo.
• Puntas con Filtro de 10; 20; 200; 1000 µL.
• MicroAmp 96-Well Reaction Plate (AB).        
• Películaauto adherente, para placas de 96 pozos (AB).
• Arreglos 3130 & 3100 Capillary Array 36 cm (AB)
• Tubo para PCR Multiply- Pro cup 0.2 ml.
• Tubo de 1.5 ml graduated microcentrifuge Clear.
• Cubre boca de alta eficiencia N95 “kimberly Clark”.
• Kimwipes paños para tareas delicadas “Kimberly Clark”.

PROCESO

1. EXTRACCIÓN AUTOMÁTIZADA.

Homogenizar por inversión el tubo Lila con muestra, tomar 300µl de sangre total  y colocarlo en el primer pozo del cartucho de extracción y 300 µl de buffer de elusión en el último pozo, así como el plunger (Embolo magnético).Colocar los cartuchos en el equipo MAXWell 16 AS200Promega. 35 min. De extracción y 10 min. De recuperación de elusión. Tiempo total 45min.

1. PCR DETECCION  LAB 2 (LV).

Colocar a -20ºC,  1 Cooling racks  para tubos de 1.5 ml,  2 Cooling racks para tubos PCR Descongelar ell Kit 3 y 4: Mol Taq 16s, DNA StartingSolution (SS) mantener en oscuridad Master Mixer Bacterias, Master Mixer Levaduras, Master Mixer CI (LAB1), H2O libre de DNA  y  Control Positivo. Coloque en vortex unos cuantos segundos los reactivos y centrifugue a 1000 rpm.

Preparación de MasterMix (MA) para Bacterias, Levaduras y Control Interno.

Preparar por separado la reacción en un vial de 1.5 ml estéril para 11 muestras

Colocar un tubo por cada muestra, 1 tubo para el Control P1 y  P2 por serie; un tubo para el Control Negativo por serie y un tubo para cada muestra para el Control Interno.

Serie de bacterias y levaduras: Colocar en un rack tubos de 200 µl de cada muestra por duplicado añadir 20 µl de Mezcla maestra de bacterias y levaduras respectivamente en cada tubo.

Controles Negativos: Colocar 20 µl de mezcla maestra y 5 µl de agua libre de DNA

Serie de Controles: Preparar el master del Control Interno (Tapa amarilla) en el LAB 1 UV con las mismas cantidades que se describieron anteriormente. (Se puede preparar la mezcla en la misma campana)

Adición de muestra

LAB 1 (FLUJO LAMINAR Y  LV)

Añada a cada tubo 5ulde producto de PCR a los 3 tubos(bacterias, levaduras y control interno.

Nota: Vortexear las muestras antes de añadir a cada tubo.                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                            

Controles:

Preparar control positivo: P1 2.0 µl  directo sin diluir

                                         P2 2.0 µl ┼ 1.0 ml de agua estéril libre de DNA

                                      El tubo para el control interno negativo se marca con ICw (agua)                      

Serie para el Cotrol Positivo: A los 2 tubos de cada serie que están marcados con P1 y P2 añadir 5 ul P1 Y P2 ya diluído.

Pasar los tubos a una gradilla para centrifugar a 1000 rpm durante 30 seg. Posteriormente pasar la gradilla al LAB. 3  y colocar los tubos en el termocicladorGeneAmp PCR System 9700 ABI

...