Describir el procedimiento para determinar anticuerpos tipos 1 y 2 del virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH).

1. Objetivo:

1. Describir el procedimiento para determinar anticuerpos tipos 1 y 2 del virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH).  

1. Alcance:

1. Aplica a Químicos y Técnicos Laboratoristas del Área de Serología del Banco de Tejidos del Estado de México.

1. Referencias

1. NOM-003-SSA2-1993, Para la disposición de sangre humana y sus componentes con fines terapéuticos.
2. NOM-017-SSA2-1994, Para la vigilancia epidemiológica.
3. NOM-166-SSA1-1997, Para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos.
4. NOM-168-SSA1-1998, Del expediente clinico.
5. NOM-039-SSA2-2002, Para la prevención y control de las infecciones de transmisión sexual.
6. NOM-010-SSA2-2010, Para la prevención y el control de la infección por Virus de la Inmunodeficiencia Humana.
7. Prevention and treatment of HIV and other sexually transmitted infections among men who have sex with men and transgender people. Recommendations for a public health approach. OMS. 2011
8. Regional HIV/STI Plan for the Health Sector. 2006-2015. Panamerican Health Organization. NOVEMBER 2005.
9. SSA-067-08. Diagnóstico y referencia oportuna del paciente con infección por el VIH en el primer nivel de atención. Consejo de Salubridad General.

1. Responsabilidades

1. Es responsabilidad del Jefe de  y del Coordinador de Control de Calidad revisar y autorizar el presente procedimiento para su aplicación.
2. Es responsabilidad de Químicos y Técnicos Laboratoristas conocer y aplicar correctamente este procedimiento.

1. Definiciones (introducción y conceptos específicos)

El Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) se caracteriza por una serie de infecciones oportunistas con resultados fatales. El agente causal de este padecimiento es un retrovirus conocido como Virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV), cuya transmisión es posible a través de sangre contaminada, por transmisión madre-hijo durante el parto y/o lactancia, además de otras actividades de riesgo como compartir agujas contaminadas o actividad sexual no protegida con personas contagiadas.

        Como consecuencia y ante la necesidad de ayudar al diagnóstico de las personas contaminadas con este virus se desarrollaron metodologías para detectar los anticuerpos específicos que éste virus induce durante la infección, tales como ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Una prueba de ELISA no provee el 100% de seguridad en el diagnóstico del VIH, por lo cual un resultado positivo deberá confirmarse mediante técnica de Western Blot y/o PCR (polymerase chain reaction).

PRINCIPIO DE LA PRUEBA.  

                Inmunoensayo “sándwich” de doble antígeno que emplea antígenos recombinantes de VIH como gp120/gp41/gp36/p24 adheridos al fondo de los pocillos de la placa, y otros gp120/gp41/gp36/p24 unidos a la peroxidasa (HRP) de la solución del conjudado. Durante el ensayo, los anticuerpos de VIH existentes en la muestra reaccionarán con los antígenos para formar un complejo antígeno-anticuerpo-antígeno-HRP. Las partes que no se unieron se lavarán y se aplicará el sustrato e identificar el resultado de la prueba.

1. Insumos

1. HIV 1&2 ELISA Test Kit.

1. Resultados

1. Valores de referencia:

1. Técnica cualitativa:  NEGATIVO

1. Interacción con otros procedimientos

1. NA

1. Desarrollo (procedimiento)

1. Preparación de reactivos:

1. La solución de trabajo del conjugado:

1.  Diluir el conjugado al volumen requerido para analizar el total de las muestras con el diluyente del conjugado referido en la tabla de abajo.
2.  La solución de trabajo del conjugado deberá de conservarse de 2- 8°C hasta por 4 semanas.

[pic 1]

1. Buffer de lavado

1.  Diluir 1 volumen del buffer de lavado concentrado con 19 volúmenes de agua desionizada o destilada. Mezclar bien.
2.  El buffer de lavado se puede conservar a temperatura ambiente hasta por una semana.

1. Procedimiento del ensayo:

1. Colocar los reactivos y muestras a temperatura ambiente (18-25°C) para el ensayo. Mezclar suavemente antes de usarlos.
2. Anotar en una hoja de proceso los números de muestras y controles que se utilizarán. Un pocillo para el blanco, cuatro pocillos adicionales para los controles y un pocillo para cada muestra.
3. Adicionar 50 ul de cada muestra y controles. (2 controles positivos y 2 controles negativos) a cada pocillo correspondiente de acuerdo con la hoja de proceso y reservar un pocillo vacío para el blanco.
4. Adicionar 100 ul de la solución de trabajo del conjugado en cada pocillo excepto para el blanco. Nota: No toque la orilla de los pocillos para evitar falsos positivos.
5. Tapar la placa con cuidado, con el sellador y mezcle el líquido en los pocillos. No derrame o salpique a los lados de los pocillos.
6. Incubar la placa a 37°C por 60 minutos.
7. Lavar cada pocillo cinco veces con el buffer de lavado preparado, de la siguiente manera: aspirar completamente el contenido de los pocillos en un frasco de desechos, llenar los pocillos con buffer de lavado (350 ul), evitando el derrame de líquidos, dejar reposar (30-60 segundos) y aspirar completamente. Lo anterior se deberá repetir cuatro veces más, para un total de cinco lavados. El lavado deberá de realizarse estrictamente de acuerdo a las instrucciones anteriores, ya que lavados incompletos pueden ocasionar resultados falsos.
8. Asegurarse de que no queden líquidos remanentes en las tiras y en los contenedores después del último lavado (usar papel absorbente).
9. Agregar 50 ul de Colorante A y 50 ul de Colorante B a cada pocillo.
10. Incubar la placa a 37°C por 20 minutos.
11. Agregar 50 ul de ácido sulfúrico 2M a cada pocillo, tape cuidadosamente la placa.
12. Mida la DO con el lector de placas a 450 nm y 630 nm como referencia.

1. Control de Calidad.

1. Los resultados de un ensayo serán válidos si se cumplieron los siguientes criterios:

1. Blanco de sustrato

1. El valor de la absorbancia debe ser menor o igual a 0.100.

1. La absorbancia de cada controle negativo después de restar la absorbancia del blanco de sustrato (CN) deberá ser menor que 0.100.

1. Sí dos valores están fuera del rango, la corrida será inválida y por lo tanto todo el ensayo deberá repetirse.

1. La absorbancia de los controles positivos después de restar el blanco de sustrato (CP), el promedio de los CP deberá ser mayor que o igual a 0.500. Si es más bajo, la corrida será inválida y el ensayo se deberá repetir.

1. Cálculos y Resultados

1. Cálculos:

1. Absorbancia promedio de los controles positivos (CPx)= (CPl+CP2)/2
2. Valor del Corte (Cut-off) =CPx X 0.100 + 0.050.
3. Dividir la absorbancia de la muestra entre el valor del corte.

1. Resultados

1. Positivo: la absorbancia de la muestra es mayor que o igual al valor del Cut-off.
2. Negativo: la absorbancia de la muestra es menor que el valor del cut-off.

NOTA IMPORTANTE: Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposición o infección con VIH.

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