Determinación de antioxidantel y fenoles

En todos los protocolos, todos los reactivos y tubos que se utilizan deben cubrirse con papel de aluminio.

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE (DPPH)

Para la determinación de actividad antioxidante en muestras líquidas:

1. Se añaden 6 mL de DPPH* (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) solución (6x10-5 M) a 200 µL de muestra en tubos cubiertos con papel de aluminio. Para el blanco se añaden 6 mL de DPPH a 200 µL de agua destilada.

1. Se incuban los tubos en un baño de agua a 37°C durante 20 minutos.

1. Tras los 20 minutos, se mide la absorbancia del blanco y las muestras a 517 nm.

1. Para calcular el % de inhibición:

% Inhibición = [pic 1]

*Para preparar la disolución de DPPH (6x10-5 M):

6x10-5M = [pic 2]

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE (ABTS)

Preparación de la solución ABTS:

1. 5 mL ABTS (7 mmol/L)* + 88 µL Persulfato de Potasio (K2S2O8 140 mmol/L)* y dejar en agitación y oscuridad durante 12-16 horas a Tª ambiente.

1. Diluir con tampón acetato o etanol al 95% hasta una absorbancia de aproximadamente 0.700 a 734 nm.

Para el análisis de muestras:

1. Se añaden 3.9 mL de solución ABTS a 100 µL de muestra en tubos cubiertos con aluminio. Para el blanco se añaden 3.9 mL de solución ABTS a 100 µL de tampón acetato o etanol al 95%.
2. Se deja reaccionar 30 minutos a temperatura ambiente y se mide la absorbancia a 734 nm.

La recta de calibrado se hace con Trolox en etanol en concentraciones de 50 a 250 ppm. No hacer “cero” en el espectro, dará una recta descendente porque mide la pérdida de color. Restar a las absorbancias el valor del blanco en todos los casos (calibrado y análisis de muestra).

*Para preparar ABTS (7 mmol/L): Se añaden 3.60 g de ABTS en un litro de agua destilada.

*Para preparar K2S208 (140 mmol/L): Se añaden 37.83 g de K2S208 en un litro de agua destilada.

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN FENOLES TOTALES

Para la determinación del contenido en fenoles totales en muestras líquidas:

1. Se añaden 3 mL de Folin-Ciocalteu (1:10) a 400 µL de muestra en tubos cubiertos con papel de aluminio. Para hacer el blanco se añaden 3 mL de Folin-Ciocalteu (1:10) a 400 µL de agua destilada.

1. Se incuban los tubos en un baño de agua a 22°C durante 5 minutos.

1. Pasados los 5 minutos, se añaden 3 mL de bicarbonato de sodio* y se vuelven a incubar en el baño a 22°C durante 90 minutos.

1. Tras ese tiempo, se mide la absorbancia a 725 nm.

*Para preparar la disolución de bicarbonato de sodio: se añaden 6 g de NaHCO3 en 100 mL de agua destilada.

La recta de calibrado se hace con ácido gálico en concentraciones de 20 a 100 ppm.

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