Determinación De Glúcidos

I) Métodos basados en el poder reductor

• Método de Fehling-Causse-Bonnans modificado (AOAC 1965, p. 495)

Reactivos:

- Solución F.C.B. (las drogas se disuelven en agua por separado y se mezclan en el orden indicado, completando a 1 litro con agua destilada en matraz aforado).

Tartrato de sodio y potasio 130 gr

Hidróxido de sodio 110 gr

Sulfato de cobre cristalizado 24 gr

Ferrocianuro de potasio 16,8 gr

- Solución acuosa de azul de metileno al 1%

- Solución de glucosa o azúcar invertido 0,5%

1) Valoración del reactivo: En un erlenmeyer de 250 ml de capacidad se colocan exactamente 10 ml de reactivo FCB, 30 ml de agua destilada y 2 o 3 trozos de porcelana porosa y se calienta a ebullición. Una vez alcanzada ésta, se comienza a agregar desde la bureta especial la solución patrón de azúcar a una velocidad de goteo controlada (medirla) evitando interrumpir la ebullición. Cuando la coloración azul del reactivo disminuye de intensidad o alcanza un tono celeste verdoso, se agregan 3 gotas de la solución acuosa de azul de metileno y se continúa con el agregado de solución patrón, gota a gota, hasta decoloración. La primera gota que torna a amarillo oro parte de la solución indica el punto final. Se debe realizar esta valoración por duplicado.

Deben gastarse alrededor de 5-6 ml de la solución patrón para decolorar 10 ml de reactivo de FCB. Si el volumen gastado cae fuera de estos valores hay que modificar la velocidad de adición hasta lograr el valor indicado. La velocidad de goteo encontrada como óptima será la empleada al valorar las soluciones problema.

Nota: No hace falta agitar el erlenmeyer con las manos, la misma ebullición sirve de agitación.

2) Glúcidos solubles (directamente reductores y reductores previa hidrólisis ácida)

Pesar una cantidad de muestra de acuerdo con la cantidad de azúcares solubles, como para obtener una concentración en la solución final de aproximadamente 0,5%, disolverla en agua destilada, agregar 5 ml de defecante (subacetato de plomo 30%), mezclar, dejar decantar y eliminar el exceso de plomo soluble por agregado de oxalato o sulfato de sodio. Completar a volumen de 100 ml con agua destilada en matraz aforado, homogeneizar por inversión (tratando de solubilizar o dispersar perfectamente la muestra) y dejar decantar 30 min. Filtrar por papel y determinar en el filtrado los azúcares reductores por el método de Fehling-Causse-Bonnans o bien por el de Nelson-Somogyi.

2.1) Valoración de glúcidos solubles reductores: Se titulan 10 ml de reactivo FCB según el procedimiento seguido en a) pero esta vez cargando la bureta con la solución de azúcares solubles obtenida a partir de la muestra (filtrado). El gasto de esta valoración debe estar comprendido entre 3 y 8 ml, si no es así hay que modificar la concentración de la solución de azúcares.

Nota 1: Es conveniente que el agregado de solución de azúcares (patrón y problema) se haga al principio a razón de 1 gota/segundo y después del agregado de azul de metileno, a 1 gota/3 segundos.

Nota 2: Se debe tener sumo cuidado en la observación del punto final de la titulación, pues la coloración amarilla cambia rápidamente a parda.

2.2) Glúcidos solubles reductores previa hidrólisis ácida: En vaso de precipitado de capacidad conveniente, se colocan 50 ml del filtrado preparado para determinar glúcidos directamente reductores (punto b), se agregan 1-2 ml de HCl puro (:1,19), se lleva a baño María por espacio de 2 horas, se neutraliza con solución de NaOH o con NaHCO3 sólido y se lleva al volumen inicial (50 ml) con agua destilada. Filtrar y en el líquido filtrado valorar los azúcares reductores mediante la técnica descripta en b).

Cálculo: Los glúcidos directamente reductores se expresan comúnmente en porcentaje de glucosa y los no reductores (calculados a partir de la diferencia c-b) son expresados en porcentaje del disacárido mayoritario, multiplicando por el factor correspondiente.

3) Glúcidos totales (solubles e insolubles): Método directo por hidrólisis ácida y valoración de los azúcares reductores liberados.

Reactivos:

- HCl :1,125

- NaOH 10% y 40%

Calentar la cantidad adecuada de muestra con 200 ml de agua y 20 ml de la solución de HCl en un balón de 500 ml con refrigerante a reflujo durante 2 hs. Enfriar y llevar a neutralidad con NaOH (comenzar la neutralización con el NaOH 40% y finalizar con NaOH 10%). Trasvasar a un matraz aforado y llevar a 500 ml. Agitar y filtrar desechando las primeras gotas. Valorar la glucosa liberada por el método de FCB modificado (método b).

4) Tratamiento previo de la muestra para determinar azúcares en dulce de leche:

Pesar 10 gr de dulce de leche en un vaso de precipitado tarado, agregar una cucharadita de arena calcinada y eliminar la grasa con 3 porciones de 10 ml de éter etílico, agitando cada vez con ayuda de una varilla (desechar las fases etéreas). Evaporar el exceso de éter en baño de agua a 40-50°C. Agregar aproximadamente 60 ml de agua destilada a 37°C y agitar hasta completa homogeneización. Lavar bien la varilla y continuar como en b) o c) según lo que se quiera determinar.

• Método microcolorimétrico de Nelson-Somogyi

Se utiliza para la determinación de azúcares reductores.

Reactivos:

- Reactivo de sulfato de cobre: disolver 28 g de Na2HPO4 anhidro y 4 g de tartrato de sodio y potasio en aproximadamente 700 ml de agua destilada. Agregar 100 ml de NaOH 1N agitando, y luego 80 ml de CuSO4 10% (p/v). Cuando se disolvió todo agregar 180 g de Na2SO4 anhidro y diluir a 1 litro. Dejar descansar un día y luego decantar el sobrenadante claro. Este reactivo se puede guardar indefinidamente.

- Reactivo de arsenomolibdato: disolver 25 g de molibdato de amonio en 450 ml de agua destilada, agregar 21 ml de H2SO4 conc. y mezclar. Luego agregar 3 g de Na2HAsO4.7H2O disueltos en 25 ml de agua dest. Mezclar e incubar a 37°C por 24-48 hs. Guardar en frasco color caramelo, preferiblemente en un armario.

- Glucosa standard: solución madre de glucosa 1% (p/v) en ácido benzoico saturado. La solución madre se diluye para obtener soluciones standard de 50, 150 y 300 g/ml.

Determinación:

Se debe hacer un blanco y una curva de calibración con cada serie de muestras. La reacción se lleva a cabo en tubos de ensayo (16 mm x 150 mm) con tapones de vidrio o bolitas de vidrio. Colocar en sendos tubos 2 ml de reactivo de cobre y 2 ml de solución a ensayar. Poner los tubos en un baño de agua hirviendo durante 10 min. Enfriar 5 min. en agua corriente. Agregar 1 ml de

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