Determinación Proteínas

Determinación de nitrógeno y proteínas

Métodos no extractivos

• Determinación de Proteínas totales: Determinación del nitrógeno total por el Método de Kjeldahl (Método de Referencia)

Aplicaciones: Alimentos en general

Como consecuencia de su estructura a base de aminoácidos individuales, el contenido en nitrógeno de las proteínas varía sólo entre unos límites muy estrechos (15 a 18%; en promedio 16%). Para la determinación analítica del contenido en proteína total, se determina por lo general el contenido de nitrógeno (N) tras eliminar la materia orgánica con ácido sulfúrico (método de Kjeldahl), calculándose finalmente el contenido de proteína con ayuda de un factor (en general f = 6,25). Se asume que el SO3 que se forma durante el tratamiento a altas temperaturas se adiciona como ácido de Lewis al grupo NH del enlace peptídico (base de Lewis) de la proteína, formándose el correspondiente ácido amidosulfónico, el que posteriormente se transforma en sulfato amónico por degradación. El sulfato amónico se determina a continuación, tras liberación del NH3 y destilación, por medio de una valoración ácido-base.

Como en el tratamiento Kjeldahl de alimentos no se determinan sólo proteínas o aminoácidos libres, sino también ácidos nucleicos y sales de amonio y también nitrógeno ligado de compuestos orgánicos o vitaminas, el nitrógeno ligado orgánico se expresa como ¨nitrógeno total calculado como proteína¨ o como ¨proteína total¨ (N x f).

No obstante, como por lo general los alimentos sólo contienen cantidades traza de compuestos aromáticos nitrogenados y de vitaminas, el error así cometido se considera despreciable.

Fundamento: La sustancia a investigar se somete a un tratamiento oxidativo con ácido sulfúrico concentrado en presencia de una mezcla catalizadora (las sales/óxidos metálicos sirven para el transporte de oxígeno con formación intermedia de oxígeno naciente; el sulfato potásico sirve para elevar el punto de ebullición, alcanzándose temperaturas de 300-400°C durante la digestión). Del sulfato amónico formado se libera el amoníaco por tratamiento alcalino y éste se transporta con ayuda de una destilación en corriente de vapor a un recipiente con ácido bórico y se realiza una titulación con una solución valorada de ácido sulfúrico. El contenido en proteína de la muestra se calcula teniendo en cuenta el contenido medio en nitrógeno de la proteína en cuestión.

Reactivos:

H2SO4 conc. p.a. (98%)

Catalizador: K2SO4 o Na2SO4 anhidro + CuSO4. 5 H2O p.a. (relación 10:1)

NaOH 40%

Solución H3BO3 4%

Solución H2SO4 0,2 N

Indicador Mortimer: 0,016% rojo de metilo, 0,083% verde de bromocresol en etanol

Determinación:

a) Digestión: Colocar la cantidad adecuada de muestra (de acuerdo al contenido estimado de nitrógeno) entre 0,1 y 4 g con una precisión de  1 mg, en un balón Kjeldahl de 500 ml. Agregar 1 cucharadita de catalizador, perlas de vidrio y 15-20 ml de H2SO4 conc. Todo el material debe estar sumergido en el ácido para que no haya pérdidas de nitrógeno. Conectar el balón a la trampa de agua y calentar la mezcla suavemente hasta que cese el desprendimiento de espuma; luego calentar enérgicamente hasta completar la digestión de la materia orgánica (no se observan partículas carbonosas sin oxidar y el líquido queda translúcido y de color débilmente verdoso o azul-verdoso). La digestión demanda entre 1 y 2 hs. Enfriar y agregar cuidadosamente al menos 100 ml de agua.

b) Destilación: Presentar el balón con la muestra digerida a un refrigerante por medio de una trampa adecuada. Preparar un erlenmeyer con 25-50 ml de H3BO3 4% (sobre el cual se va a recoger el NH3 destilado) y gotas de indicador Mortimer (color rojo), y colocarlo a la salida del refrigerante cuidando que el extremo del mismo quede sumergido en la solución ácida. Antes de conectar completamente el balón se va agregando con cuidado la cantidad necesaria de solución de NaOH 40% como para neutralizar el ácido sulfúrico, primero sin agitar para que se ubique en el fondo, y una vez agregado todo, conectar bien el balón, agitar para lograr la mezcla (el medio se hace fuertemente alcalino que se detecta por formación de un precipitado pardo oscuro, dispersado por efecto de la ebullición) y simultáneamente se comienza el calentamiento a ebullición del contenido del balón. El indicador vira a azul cuando empieza a destilarse el NH3 por arrastre en corriente de vapor. Se sigue destilando hasta llegar a aproximadamente 200 ml en el erlenmeyer colector (los primeros 150 ml de destilado contienen generalmente la totalidad del NH3). Una vez alcanzado dicho volumen, se retira el erlenmeyer enjuagando dentro del mismo el extremo del refrigerante con AD, para no perder nitrógeno y luego se apaga el calentamiento.

c) Valoración: El destilado se valora con solución de H2SO4 0.2 N, hasta lograr el viraje del indicador Mortimer al color inicial rojo.

d) Blanco: Se debe realizar un blanco de reactivos, siguiendo las mismas indicaciones pero sin colocar muestra en el balón.

Cálculos:

Proteína total % = (VMyestra - VBlanco) x NAcido x 0.014 x F x 100/gMuestra

Siendo VMuestra ml de ácido gastados en la valoración de la muestra

VBlanco ml de ácido gastados en la valoración del blanco

NAciodo normalidad del ácido sulfúrico

0.014 peso del meq de nitrógeno, en g

F factor de conversión de nitrógeno a proteína

gmuestra peso en g de la muestra

En los cálculos para convertir nitrógeno a proteínas, usar el factor 6,25 para carnes, 5,7 para cereales y soja y 6,38 para leche y derivados.

• Determinación de Nitrógeno básico volátil- Índice de putrefacción

Aplicación: carne vacuna, pescado

Fundamento: El pH de músculo de pescado fresco está entre 6,6 y 6,8 (lo conserva en el momento de la muerte). Después de muerto se acumula ácido láctico, provocando caída de pH, pero como en el músculo hay compuestos con carácter buffer, no permiten que se vea ese descenso. Por descomposición del músculo se acumulan amoníaco, dimetilamina y trimetilamina. Si en ese momento se produce contaminación bacteriana, entonces comenzará a subir el pH (primero lentamente y rápido al final), en condiciones extremas de deterioro puede llegar a 7,5-8,0. Ocurre un proceso de autolisis que lleva al aminoácido:

R-CH-NH2-COOH CO2 + R-CH2-CH2-NH2

Decarboxilasas

Aminooxidasas

NH3 +

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