EXTRACCIÓN DE SANGRE Y ÓRGANOS LINFOIDES DE RATÓN. AISLAMIENTO DE LINFOCITOS

EXTRACCIÓN DE SANGRE Y ÓRGANOS LINFOIDES DE RATÓN. AISLAMIENTO DE LINFOCITOS.

1. INTRODUCCIÓN

En inmunología humana es frecuente el empleo de animales de laboratorio para la obtención de antisueros o complemento, para la generación de anticuerpos monoclonales o para la producción de líquido ascítico a partir de hibridomas. En esta práctica se aprenderán las técnicas básicas de manipulación de ratones que pueden tener utilidad en Inmunología. Se llevarán a cabo técnicas de inyección subcutánea e intraperitoneal, extracción de sangre del plexo axilar y mediante punción intracardiaca, extracción de órganos linfoides y aislamiento de células a partir de estos tejidos sólidos.

Los ratones deben ser manipulados con cuidado pero con decisión para evitar estresar al animal, lo que puede resultar en mordeduras o arañazos al experimentador y en daños innecesarios al animal. Debe tenerse en cuenta que los ratones son más agresivos que las ratas y tenderán a morder instintivamente.

2. OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:

Sujetar manualmente los ratones para ser correctamente inyectados, sin riesgo personal y sin dañar al animal.

Extraer sangre y preparar suero.

Anestesiar ratones por inhalación

Abrir el abdomen y extraer el bazo.

Localizar y extraer ganglios linfáticos.

Abrir el tórax y extraer el timo.

Disgregar los tejidos para obtener células viables.

3. EQUIPAMIENTO

Ratones Swiss o similares adultos, no importa el sexo.

Material de disección: Guantes, tijeras, bisturí, pinzas, jeringuillas y agujas para insulina.

Vaso de precipitado de 1000 cc o recipiente de vidrio con tapa.

Tubo de 50 ml con tapa.

Tubos de poliestireno de 5ml y gradilla.

Placas de cultivo de 24 pocillos.

- Pipetas de 5 50 µl y 200 1000 µl y puntas.

- Contenedor para material cortante.

4. REACTIVOS

Etanol 70%

Eter dietílico anestésico

Tampón PBS pH 7.2

Suero fisiológico

5. MÉTODO

A. Inyección intraperitoneal.

1. Cargar una jeringuilla con la suspensión a inyectar (en nuestro caso 2.5 ml de suero fisiológico) expulsar las burbujas de aire y dejar preparada.

2. Sacar al ratón de la jaula asiéndolo con una mano por la base del rabo y situarlo sobre la tapa para que se agarre a las barras.

3. Con los dedos pulgar e índice de la otra mano agarrar por la piel de la nuca.

4. Situar el rabo por detrás del dedo meñique para inmovilizar al ratón con una sola mano.

5. Lavar el abdomen con etanol y dejar secar.

6. Colocar al ratón ligeramente cabeza abajo.

7. Introducir la aguja en el cuadrante inferior izquierdo (o derecho) del abdomen a un lado de la línea media.

8. Inyectar con presión moderada.

B. Inyección subcutánea.

1. Cargar la jeringuilla con el líquido a inyectar (2.5 ml de suero fisiológico) y expulsar el aire.

2. Situar al ratón sobre sus patas encima de un secante.

3. Sujetar por la piel del área interescapular con los dedos índice y pulgar.

4. Introducir la aguja bajo la piel entre los dedos.

5. Inyectar con presión moderada.

C. Anestesiado por inhalación.

1. Colocar un trozo grande de algodón en un vaso de precipitado y empapar ligeramente con éter dietílico (Evitar su inhalación directa. Muy inflamable). Tapar y dejar evaporar dos minutos.

2. Preparar un tubo de 50 ml con un algodón humedecido en éter y guardar tapado. Servirá para suplementar anestesia si se requiere más tarde.

3. Introducir al animal en el recipiente

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