Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática (amilasa)

Laboratorio de enzimología y biocatálisis

Práctica 4

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática (amilasa)

Equipo 3

Jueves 20 de septiembre de 2018

Práctica No. 4

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática (amilasa)

RESUMEN

El uso de las enzimas industrialmente se deriva de la intensa investigación en los años 40’s en bioquímica. Sin embargo a partir de hace poco se comenzaron a investigar más a fondo en temas de análisis clínicos. Las enzimas poseen una serie de factores que alteran su composición y que tomados en cuenta conllevan a la factibilidad de un proceso. Estos factores variantes pueden ser la concentración, el pH, la temperatura, etc. Es por esta razón que en la presente práctica se pretende esclarecer la relación entre la temperatura con la actividad catalítica de la enzima.

INTRODUCCIÓN

A través del tiempo, el ser humano ha logrado obtener alimentos de diferentes medios y formas. Sin embargo, el almidón ha sido un compuesto utilizado en gran medida para la preparación de los mismos. Se encuentra presente de forma completamente natural en una gran variedad de alimentos así como cereales (arroz, trigo, etc) y en los tubérculos (papas, boniato, etc). Este está compuesto principalmente por glucosa, y químicamente es una mezcla de amilosa y amilopectina, dos polisacáridos parecidos (EcuRed, 2018).

Así pues, se usa la amilasa para la experimentación ya que es una enzima hidrolasa encargada de romper los enlaces 1-4 entre las unidades de glucosa presentes en el almidón y el glucógeno para formar fragmentos de maltosa, dextrinas e incluso glucosa misma. Esta tiene un pH 7 y en el ser humano, los órganos encargados de la producción de amilasa y que ayudan a la digestión son las glándulas salivares y el páncreas (ANKOM Technology, s.f.).

Sin embargo, el α-amilasa utilizada en el laboratorio durante la práctica tiene gran estabilidad con diferentes pH y en altas temperaturas, es de grado alimentario y es derivada de una cepa genéticamente modificada de Bacillus licheniformis (ANKOM Technology, s.f.).

Como en la gran mayoría de las reacciones químicas, la velocidad de reacción incrementa directamente proporcional con el incremento de la temperatura. La variación de 10ºC suele llegar a incrementar la actividad de la mayoría de las enzimas entre un 50% y 100%. No obstante, la más mínima variación de uno a dos grados centígrados puede llegar a alterar la actividad catalítica de las enzimas en un 10% a 20% (Worthington, 1972).

Así como la mayoría incrementa junto con la temperatura, hay algunas enzimas cuya actividad se ve disminuida. Sin embargo, tal como se muestra en la Figura 1, la actividad catalítica aumenta junto con la temperatura a su punto máximo, pero poco después de haber llegado a este tiene una disminución muy abrupta debido a que la gran mayoría de las enzimas provenientes de animales se ven sometidas a un proceso de desnaturalización a una temperatura de 40ºC. Es por ello que la determinación de la actividad catalítica se suele dar a temperaturas inferiores (Worthington, 1972).

[pic 1]

Figura 1. Efecto de la temperatura en la act. catalítica

No basta con considerar que se habla de la misma enzima al momento de trabajar con su temperatura óptima ya que este suele variar dependiendo del origen de esta proteína. A continuación, se presenta la tabla 1 donde se puede apreciar el concepto previo con respecto a la enzima lipasa. (González, Moreno & Monte, 2010)

Tabla 1. Ejemplos de temperaturas óptima de lipasas  

Finalmente, la ecuación de Arrhenius, es una expresión matemática empleada con el fin de confirmar la dependencia de la constante de velocidad de una reacción (K) con respecto a la temperatura a la cual se desarrolla dicha reacción química (Carvajal, s. f.).  Así pues, como se observa en la Figura 2, la ecuación de Arrhenius está representada por diferentes componentes que se ven influenciados por la temperatura.

 [pic 2]

Figura 2. Ecuación de Arrhenius y sus variables.

OBJETIVOS

General

Determinar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la amilasa empleando como sustrato almidón.

Específicos

• Preparar adecuadamente el buffer de acetatos.
• Llevar a cabo las adiciones de amilasa en el tiempo requerido.
• Tener un buen manejo de los elementos del laboratorio .
• Realizar adecuadamente la curva patrón.
• Determinar la ecuación de la curva patrón con un valor de R2 lo más cercano a 1, haciendo uso de excel.
• Realizar y dominar los cálculos necesarios para la obtención de la actividad enzimática.
• Describir la relación presente entre la temperatura y la velocidad de reacción de la enzima.
• Determinar la concentración de azúcares reductores.
• Expresar la actividad enzimática en unidades de actividad de amilasa/mL (U/mL).
• Expresar la actividad enzimática en unidades de actividad de amilasa/mg de proteína (U/mg).
• Realizar las gráficas U/mL contra tiempo de reacción para cada temperatura.
• Graficar los valores máximos obtenidos de U/mL para cada caso contra temperatura.
• Determinar la energía de activación de la enzima con la ecuación de Arrhenius
• Obtener la temperatura óptima donde actúa la amilasa.

ESQUEMA METODOLÓGICO

Con el fin de poder llevar a cabo la práctica de forma más fluida y con mucha más precisión, es necesario contar con los siguientes materiales y reactivos indispensables que se requieren para el proceso, por lo que se enlistan a continuación:

Materiales y reactivos

• Almidón de papa
• α-amilasa (ANKOM Technology)
• Reactivo de Bradford
• Reactivo de DNS (Aldrich)
• Acetato de sodio trihidratado (CH3COONa.3H2O) (Productos Químicos Monterrey, S.A.)
• Ácido acético glacial (CH3COOH) (J.T. Baker, 9508-02)
• Fosfato de sodio monobásico monohidratado (NaH2PO4.H2O) (J.T. Baker, 3818-01)
• Fosfato de sodio dibásico heptahidratado (Na2HPO4.7H2O) (Karal S.A. de C.V.)
• Soluciones buffer pH 4 y pH 7
• 40 tubos de ensaye de boca ancha con rosca de 15 x 180
• 2 gradillas
• 1 matraz aforado de 100 mL
• 1 matraz aforado de 50 mL
• 1 matraz aforado de 25 mL
• 1 cuba de vidrio grande
• 2 vasos de precipitado de 250 mL
• 2 vasos de precipitado de 50 mL
• 1 probeta de 100 mL
• 1 espátula
• 1 pipeta de 10 mL
• 1 pipeta de 5 mL
• 1 pipeta de 1 mL
• 2 propipetas o pera de succión
• 1 piseta
• 3 barras de agitación mediana
• 1 termómetro
• Guantes de asbesto
• 1 vortex
• 1 parrilla de calentamiento con agitación
• 1 espectrofotómetro
• 1 potenciómetro
• Papel aluminio
• Microceldas de plástico para espectrofotómetro
• 2 micropipetas automáticas de 1000 mL
• 1 micropipetas automáticas de 200 mL

Precauciones con los Reactivos

• Fosfato de sodio dibásico heptahidratado (Na2HPO4.7H2O) (Karal S.A. de C.V.)

Ligeramente peligroso. Dañino si se inhala o se ingiere, puede causar irritación en ojos y piel.

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