Enzyme-linked immunosorbent assay

Enzyme-linked immunosorbent assay

Método: No competitivo

Tipo: Elisa Directo

Detecta antígenos

Principio: Primero la muestra es añadida a los pocillos de la microplaca e incubada. La muestra contiene el antígeno de interés (Figura 1.1). El antígeno se adsorbe sobre la superficie del pozo. Luego, los pocillos se lavan a fondo, dejando solo el antígeno absorbido. Los sitios del pozo restantes se bloquean. Luego se agrega a los pocillos un anticuerpo donde se une al antígeno de interés. El pozo se lava de nuevo. Formando un complejo antígeno-anticuerpo unido en la superficie del pocillo (Figura 1.2). El anticuerpo está ligado a una enzima. Luego se agrega un sustrato que será convertido por la enzima en un producto detectable (Figura 1.3). La detección puede ser basado en color, fluorescencia o luminiscencia2.

Componentes:

• Un antígeno o un anticuerpo específico marcado con una enzima (conjugado).
• Un soporte para dicho antígeno o anticuerpo.
• Un sustrato que será transformado por la enzima en un producto detectable.

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Figura 1.1

[pic 2]

Figura 1.2

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Figura 1.3

Este método tiene la ventaja de ser más rápido y sencillo. que los otros métodos ELISA, con menos pasos y solo uno anticuerpo. Sin embargo, tiene algunas limitaciones. En complejo muestras, que contienen una variedad de proteínas diferentes, habrá una variedad de proteínas adsorbidas en el pozo que no son el antígeno de interés. Esto resulta problemático cuando el antígeno de interés es escaso ya que la sensibilidad de la prueba es reducida. Otro problema es que el anticuerpo debe tener un enzima que se le atribuye. Este proceso costoso y lento debe repetirse para cada ELISA individual, un problema evitado por los otros métodos. Además, conjugar el anticuerpo con un enzima tiene el potencial de reducir la afinidad del anticuerpo al antígeno, y así reducir la sensibilidad una vez más3.

Aplicaciones:

• Enfermedades producidas por parásitos
• Enfermedades producidas por Micoplasmas
• Enfermedades producidas por
• Enfermedades producidas por virus
• Enfermedad de Newcastle, Peste porcina, Rotavirus, artritis vírica
• Hormonas
• Cuantificación de inmunoglobulinas4.

Enzyme-linked immunosorbent assay

Método: No competitivo

Tipo: Indirecto

Detecta anticuerpos

Principio:  Se adhiere una muestra que debe analizarse para un antígeno específico a los pocillos de una placa de microtitulación (Figura 2.1), seguido de una solución de proteína que no reacciona, como albúmina de suero bovino, para bloquear cualquier área de los pocillos no recubiertos con el antígeno. El anticuerpo primario, que se une específicamente al antígeno (Figura 2.2), luego se agrega, seguido por un anticuerpo secundario conjugado con enzima (Figura 2.3). Un sustrato para que la enzima se introduzca para cuantificar el anticuerpo primario a través de un cambio de color. La concentración de anticuerpo primario presente en el suero se correlaciona directamente con la intensidad del color3.

Componentes

• Un antígeno de interés
• Anticuerpo primario
• Anticuerpo específico marcado con una enzima  
• Un sustrato que será transformado por la enzima en un producto detectable.

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Figura 2.1

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Figura 2.2

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Figura 2.3

Una de las principales desventajas del ELISA indirecto es que el método de inmovilización del antígeno no es específico. Cuando suero se utiliza como antígeno de prueba, todas las proteínas de la muestra pueden adherirse a los pocillos de una placa de microtitulación. Esta limitación, sin embargo, puede superarse utilizando un anticuerpo de captura exclusivo del antígeno de prueba específico para seleccionarlo del suero4.

Aplicaciones:

• Enfermedades producidas por parásitos
• Enfermedades producidas por Micoplasmas
• Enfermedades producidas por
• Enfermedades producidas por virus
• Enfermedad de Newcastle, Peste porcina, Rotavirus, artritis vírica
• Hormonas
• Cuantificación de inmunoglobulinas4.

Enzyme-linked immunosorbent assay

Método: No competitivo

Tipo: Sándwich

Principio: Un anticuerpo complementario al de el antígeno (anticuerpo de captura) se agrega primero a la placa donde se adsorbe al pozo (Figura 3.1). Se agrega un agente de bloqueo como antes y luego se agrega una muestra. Solo el antígeno de interés puede permanecen en la placa, ya que pueden unirse al anticuerpo2.

El resto del experimento ahora puede continuar de la misma manera. como un ELISA directo o indirecto. El claro beneficio de este método es  una mayor sensibilidad. Eso, Sin embargo, tiene un costo. Para que este método funcione, dos Se requieren anticuerpos específicos de antígeno4.

Componentes:

• Antígeno de interés
• Anticuerpo de detección
• Anticuerpo específico marcado con una enzima (anticuerpo de captura)
• Un sustrato que será transformado por la enzima en un producto detectable.

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Figura 3.1

[pic 8]

Figura 3.2

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Figura 3.3

Si se utiliza un anticuerpo secundario (como en ELISA), es importante que la captura y los anticuerpos primarios se crían en diferentes especies. Esto se debe a que la secundaria el anticuerpo se generará contra la especie del anticuerpo primario4.

Aplicaciones:

• Hormonas (GCH, Progesterona, Testosterona.)
• Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA)
• Inmunopatología (Ac anti-DNA, Factor reumatoide, Inmunocomplejos circulantes)

Enzyme-linked immunosorbent assay

Método: Competitivo

Principio: Este método requiere dos ligandos para competir entre sí. para un número limitado de sitios de anticuerpos. Un ligando será el antígeno de interés, y uno será una molécula similar que es capaz de unirse al anticuerpo, pero tiene una variación que permite una molécula adicional para unirse exclusivamente a ella. Esto a menudo se logra añadiendo biotina al antígeno de interés. El antígeno y el el antígeno biotinilado competirá por el mismo sitio en el anticuerpo. La señal generada por este ensayo será inversamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra3.

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