Extracción de ADN de sangre bovina

Tema

Extracción de ADN de sangre bovina.

Objetivo

Extraer el ADN de sangre bovina.

Reactivos

• Buffer de tens de 400 ul.
• Proteinasa K de 5 ul.
• Cloruro de sodio 200 ul.
• Sangre de bovino 400 ul.
• Gel de agarosa de 1%.
• Solución amortiguadora TAE.
• Bromuro de etidio 2 ul.
• Parafina.

Materiales y equipo

• Mandil.
• Guantes.
• Micropipeta de 2 a 20 ul.
• Gradilla.
• Tubos de eppendorf.
• Vortex.
• Puntas blancas.
• Puntas amarillas.
• Microcentrífuga.
• Transiluminador con luz violeta.
• Gradilla flotan

Procedimiento

Se añade en los 8 tubos de eppendorf la sangre de bovino, a cada tubo de eppendorf se le añade con la micropipeta y las puntas blancas 200 ul de solución salina para poder lavar la sangre se homogeniza por medio de vortex durante 10 segundos y luego se lo centrifuga un minuto y medio a 12.000 revoluciones por minuto, este proceso se lo repite por dos ocasiones para ir poco a poco eliminando el exceso de proteínas que tenemos en nuestro ADN.

Después de realizar los tres lavados se procede a añadir 400 ul de extracción TENS (Es una mezcla de 50 mm de Tris-HCI, 50 mm de EDTA, 100 mm de NaCI Y 1% de SDS) y 5 ul de Proteinasa K (La Proteinasa K nos ayuda a eliminar los restos celulares para así poder obtener un ADN puro).

Antes de proceder a incubar se homogeniza la muestra mediante el vortex, cuando se haya terminado de homogenizar las muestras, se transfieren las muestras en las gradillas flotantes para así proceder a incubar a 56 °C por una hora.

Luego de que haya pasado la hora incubando se agrega 1 volumen de “fenol 25 mg/cloroformo 24 mg/isoamil 1 mg”, se procede a homogenizar en el vortex por 10 segundos hasta formar una emulsión.

Se vuelve a centrifugar las muestras durante 5 minutos a 10.000 revoluciones por minuto, luego de haberse centrifugado podemos ver que nuestras muestras están separadas por tres colores distintos (La parte acuosa es el ADN, la pequeña franja negra son las proteínas y la grasa) se transfiere la parte superior acuosa con cuidado sin extraer parte de la proteína a un nuevo tubo, se procede a congelar a -20 °C durante 24 horas.

Después de realizar el proceso anterior procedemos a aplicar etanol 35%. Homogenizamos para ayudar a la precipitación del ADN se vuelve a centrifugar a 10.000 revoluciones por 5 minutos.

Luego de haber centrifugado se descarta el etanol 35% y se vuelve a poner etanol, pero esta vez al 70%, se vuelve a centrifugar a 10.000 revoluciones por 5 minutos, se procede a descartar nuevamente el etanol 70% y se deja secar durante 10 minutos.

Se añade a la muestra 50 ul de buffer de tens con esto se resuspende el ADN y se tapa el tubo, se procede a hacer cosquillas al tubo de eppendorf para homogenizar.

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