Hidrólisis enzimática

METODOLOGÍA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

1. Materiales

• Material a hidrolizar (cascarilla de cacao procesada y sin procesar) previamente pretratado. El material debe estar a un pH  entre  5,2 y 5,8.
• Ácido o base para estabilizar el pH al valor requerido.
• Pipetas Pasteur.
• Enzima Optimase CX 255L.  
• Baño María con agitación.
• Baño de hielo.
• Viales  de 2ml
• Micropipetas
• Puntas
• Tapones de algodón

• Para determinar si 1 gramo de enzima equivale a 1 mililitro de enzima es necesario conocer su densidad, para esto se toma un volumen conocido de enzima y se pesa en la balanza analítica.

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En base a lo anterior se asume que 1 gramo de enzima equivale a 1 mililitro de enzima y que la concentración de la enzima es del 100%.

1. Condiciones del proceso

PH: 5,2 - 5,8.

Temperatura: 75 °C

Tiempo: 8 – 12 horas

Dosificación de la enzima: 0,05µL de enzima por cada gramo de sustrato.

1. Procedimiento

• Preparar una solución de concentración conocida (1%) a partir de la muestra de enzima al 100%.[pic 3]

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• Para la hidrólisis del material procesado se deben adicionar 75 µL de la solución de enzima al 1%  y para la hidrólisis del material sin procesar se debe adicionar 52,5 µL.

• En cada Erlenmeyer con el material previamente pretratado se debe adicionar la cantidad de enzima correspondiente, de acuerdo a la cantidad en gramos de material (cascarilla) en solución.  

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• Una vez adicionada la enzima llevar inmediatamente al baño maría previamente calentado a 75 °C y a velocidad de agitación de 140 rpm por 8 a 12 horas.
• Después de iniciada la hidrólisis, tomar cada hora una alícuota de la fracción líquida y reservar  en viales bajo refrigeración (4°C) hasta análisis en HPLC
• Pasado el tiempo de hidrólisis sacar todos los erlenmeyers y llevar a baño de hielo hasta enfriar, esto con el fin de detener el proceso de hidrólisis.
• Almacenar todos los erlenmeyers bien tapados después de ajustado el pH a una temperatura de 4°C hasta su posterior uso.

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