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TECNICA DE HIBRIDACION IN SITU

Técnica mediante la cual estudia la distribución y densidad de un gen o molécula de ARNm en una célula o un tejido utilizando una sonda de ADN o ARN de una sola cadena. Hibridación :(proceso mediante le cual dos cadenas complementarias de ácido nucleico forman una doble hélice durante un período de unión).

Existen variaciones en la técnica dependiendo de los tipos de sondas que se utilicen (ADNc, oligonucleótidos, ARN).

Existen dos tipos de técnicas de hibridación dependiendo de cómo estén marcadas las sondas: Técnica isotópica ó radioactiva (sondas marcadas con: 32P, 35S, 3H) y Técnica no isotópica o no radioactiva. (sondas marcadas con: digoxigenina, peroxidasa etc).

Protocolo estándar:

1-Fijación del tejido o las células con paraformaldehido (PFA) 4% durante unas horas.

2-Crioprotección del tejido en sacarosa al 30% en tampón fosfato (PB) 0,1M a 4ªC toda la noche (este paso sólo se realizará en el caso de secciones de criostato).

3-Secciones de 10 a 25 micras de grosor.

4-Hibridación

-.--a)-Incubar las secciones en proteinasa K durante 15 min a 37ªC.

-.--b)-Delipidar el tejido deshidratando en alcoholes crecientes comenzando por 2 x 5 min en H2O, en Dietil pirocarbonato (DPC) 0,02% (50ml DPC en 250ml H2O autoclavado), 50,70, 95, y 100% en etanol, y rehidratar hasta H2O DPC.

-.--c)-Preincubar las secciones en solución de prehibridación (50% formamida desionizada, 0,1% ADN de esperma de salmón, 2 x SSC, 10X solución Denhardt´s, 0,1% SDS) durante una hora a temperatura ambiente.

-.--d)-Hibridación. Añadir solución de prehibridación hasta conseguir una concentración de 0,5-2,0 x 105 cpm por 50ml de solución de hibridación. En el caso de utilizar oligo-sondas marcadas con digoxigenina se puede utilizar unos 20ng de sonda por ml de tampón. Escurrir la solución de prehibridación de las secciones. Añadir la solución de hibridación, se utilizará un volumen de unos 50ml por sección.

-.--e)-Incubar las secciones toda la noche en cámara de humedad a unos 45ªC.

-.--f)-Lavar las secciones con 2x SSC (NaCl-sodio citrato) cambiar la solución cada 15 min durante 3 hr a temperatura ambiente.

-.--g)-Secar las secciones al aire.

-.--h)-Visualización de la señal: -En el caso de la técnica radioactiva se realizará autorradiografía . Cubriendo las secciones con emulsión fotográfica y exponerlas durante 3-7 días a –70ªC. -En el caso de tratarse de la técnica no radioactiva, las secciones se incubarán con un anticuerpo secundario dirigido contra la sustancia con la que estaba marcada la sonda (ej. anticuerpo anti-digoxigenina o anti-biotina) siguiendo posteriormente el protocolo según lo expuesto en las técnicas inmunohistoquímicas.

5-Controles -Incubar con la solución de hibridación sin sonda. -Incubar con ARN asa antes de la hibridación -Incubar las secciones con solución de hibridación conteniendo 400 veces de de sonda no marcada o con sonda no relacionada de tamaño similar.

*Los tiempos, temperaturas y concentraciones de las sondas variaran en cada caso particular dependiendo del tipo de tejido y de la sonda.

Hibridación "In Situ" Fluorescente (FISH)

Es una técnica molecular que permite localizar un determinado fragmento de la secuencia de los ácidos nucleicos y pone de manifiesto la presencia o ausencia de secuencias génicas específicas. Se puede aplicar sobre núcleos interfásicos de extensiones celulares o cortes de tejido o directamente en cromosomas. La posibilidad de poder utilizar las técnicas de FISH sobre células que no están dividiéndose es importante en aquellas neoplasias con baja tasa de división celular, como en los síndromes linfoproliferativos crónicos. Para ello utiliza sondas marcadas con fluorocromos. Dependiendo del tipo de sonda utilizada es posible evaluar la presencia de reordenamientos en los núcleos.

Las sondas son pequeñas secuencias de cadena sencilla de ADN, complementarias a la secuencia de interés del ácido nucleico.

Podemos utilizar distintos tipos de sondas:

■Centroméricas

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