INMUNOCITOQUÍMICA.

Trabajos prácticos

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

2015

DOCENTES:

Dra. Leopardo Noelia

Dr. Nicolas Fraunhoffer

TRABAJO PRACTICO Nº1

INMUNOCITOQUÍMICA

OBJETIVOS:

1. Análisis del procesamiento e inclusión de los distintos tipos de tejidos para su observación.
2. Diferenciación de distintos fijadores y diferentes técnicas anilínicas de coloración y sus fundamentos.
3. Reconocimiento de diferentes tipos tisulares con microscopía óptica.
4. Preparación de tejidos para el estudio microscópico: Técnica de H&E e inmunohistoquímica.

INTRODUCCIÓN:

La técnica de inmunohistoquímica utiliza anticuerpos para la localización de antígüenos en los tejidos. Esta técnica ha sido aplicada en todos los aspectos de la patología desde mediados de 1970.

Mediante esta técnica se trata de la localización e identificación de constituyentes celulares o tisulares (antígenos) por interacciones antígeno-anticuerpo. El sitio de unión se identifica por método directo, aplicando en forma directa el anticuerpo o bien usando el método del anticuerpo secundario marcado especifico contra el anticuerpo primario. Por ejemplo si el anticuerpo primario fue producido en ratón, debe utilizarse un anticuerpo secundario contra Ig de ratón, producido en otra especie.

Las enzimas acopladas a los anticuerpos catalizan la formación de un producto coloreado a partir de un sustrato y cromógeno apropiado. La presencia de un precipitado coloreado revela la localización de la enzima y por lo tanto del complejo Ag-Ac.

Esta tecnología permite un examen preciso del los aspectos del funcionamiento celular y de la morfología tisular para poder avanzar en los procesos patológicos de la enfermedad. Los anticuerpos pueden marcar varias moléculas celulares o tisulares: como hormonas, enzimas, inmunoglobulinas, receptores de la superficie celular, etc., la mayoría de los anticuerpos reaccionan contra los productos normales de la célula o con antígenos derivados de las células malignas.

Una respuesta inmunitaria específica en un animal es policlonal, en términos de producción de anticuerpos esto significa que varias células B son estimuladas al mismo tiempo por distintos epitopes en el inmunógeno. Los anticuerpos que se producen son heterogéneos respecto a su clase, afinidad y especificidad epitópica. Los anticuerpos monoclonales son el resultado de un único clon de células plasmáticas derivadas todas de una misma célula B estimulada. Los anticuerpos monoclonales tienen muchos usos. Pueden utilizarse tanto para tratar como para diagnosticar enfermedades infecciosas o debido a su exquisita sensibilidad, utilizarse en inmunoanálisis para medir concentraciones extremadamente bajas de antígenos. Los anticuerpos monoclonales contra antígenos tumorales se han utilizado para diagnosticar cánceres y presentan la posibilidad de servir como tratamiento de los tumores, especialmente cuando se combinan con una sustancia tóxica.

PROTOCOLO DE INMUNOHISTOQUIMICA: PROTOCOLO PEROXIDASA

1. Desparafinación: 3 pasajes pos Xilol de 10´ cada uno.
2. Hidratación por alcoholes decrecientes: 3 lavados de 10cada uno: Alcohol 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 50%.
3. Dos lavados de agua destilada de 10 cada uno.
4. Inhibición de la peroxidasa endógena con el bloqueador de peroxidasa del Kit a utilizar o con una solución de peroxido al 3% en metanol.
5. 3 lavados con PBS 1 X de 10cada uno.
6. Inhibición de la IgG endógena, con una solución de SFB al 10% + SAB al 15% en PBS 1 X durante 1h a Tº ambiente en cámara húmeda.
7. 3 lavados con PBS 1 X de 10cada uno.
8. Incubación con el Ac 1º, ver dilución: overnight a 4ºC.
9. 3 lavados con PBS 1 X de 10cada uno.
10. Incubación con el Ac 2º, ver dilución: durante 1 h en cámara húmeda.
11. 3 lavados con PBS 1 X de 10cada uno.
12. Incubación con Streptovidana HRP del Kit durante 20´ en cámara húmeda.
13. 3 lavados con PBS 1 X de 10cada uno.
14. Incubación con DAB cromógeno durante 5´ en cámara humada: dilución de 20ul de DAB cromógeno/1000 ml del buffer.
15. 3 lavados con agua destilada de 10cada uno.
16. Tinción con hematoxilina para el contraste durante 1´.
17. 3 lavados con agua corriente de 10cada uno.
18. Montaje con algún medio adecuando.

Preguntas:

1. Como desarrollaría controles positivos? Para que se utilizan?
2. Como desarrollaría controles negativos? Para que se utilizan?
3. Para que se inhibe la peroxidasa endógena?
4. Para que se inhiben las IgGs endógenas?
5. Por que se hidratan los tejidos?
6. Que preparación previa necesita el tejido para ser utilizado?
7. Que diferencias hay con la inmunofluorescencia?
8. Que la técnica de negativa (no se observa marca) es determinante? Que variables se pueden modificar para asegurarme de que así sea?
9. Si quiero hallar la proteína VASA del ovario humano, que anticuerpos tanto primarios y secundarios debería utilizar? Ejemplifique.
10. Miguel realizo una técnica de inmunohistoquimica para detectar una proteína citoplasmática en ratón. Utilizo una anticuerpo primario hecho en humano, anti mouse y lo revelo con un anticuerpo secundario hecho en ratón, anti-gout. Cuando revelo su técnica no detecto ninguna marca visible a 1000X. Cual podría ser la causa por la cual el no detectó expresión proteína?

PROCEDIMIENTO:

1) TÉCNICA DE H&E:

a) Colocar los cortes en xilol 10'

b) Alcohol 100 - 5' (2 cambios)

c) Alcohol 96° - 3' (1 cambio)

d) Alcohol 70° -3'(1 cambio)

e) Agua destilada 5' (2 cambios)

f) Hematoxilina 5 a 10'

g) Agua corriente 20' (viraje de hematoxilina), o hasta que el agua se ponga azul. Dos lavados con agua destilada.

h) Eosina (un pasaje).

Deshidratación:

i) Alcohol 96° (un pasaje) (con 2 gotas de ácido acético, para fijar la eosina)

...