Junín, Selva Alta

En esta oportunidad evaluaremos el accionar de la fosfatasa ácida proveniente del Hígado de Pollo, para esto se preparó un estracto del crudo de este órgano fresco, es importante verificar que el material utilizado sea fresco y se conserve congelado para evitar contaminación, putrefacción y accionar de otras enzimas hidrolíticas que pudiesen variar el resultado del experimento.

La solución en la que se extraiga la enzima debe estar constituida con un buffer, acetato en este caso, para así poder mantener las condiciones de pH ideales (pH=5) para el accionar de la enzima.

Para poder medir la actividad enzimática, usamos la misma técnica de la práctica anterior en la que la enzima en estudio la cual era la fosfatasa ácida del páncreas; esto es, usar la técnica del espectro fotómetro midiendo los niveles de fenolato liberados producto de la actividad de esta enzima.

Las mediciones de actividad enzimática son hechas considerando los periodos de incubación midiéndolos con especial cuidado y precisión para evitar errores.

El conocimiento de la cinética de las reacciones enzimáticas ayuda a comprender los fenómenos biológicos y a precisar las condiciones adecuadas de actividad enzimática para definir sus unidades y establecer comparaciones.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

• En experiencias pasadas[1] cuando se comparó los valores de kcat/Km de las

fosfatasas de hígado, de bovino, alpaca y porcino, permitió sugerir que estas enzimas tienen elevada afinidad por el sustrato p-nitrofenil fosfato. Los productos que se liberan durante la catálisis por fosfatasa ácida, muestran que el fenol o el p-nitrofenol se comportan como inhibidores de tipo no competitivo, mientras que el fosfato inorgánico muestra una inhibición de tipo competitivo.

• En trabajos realizados en la UNMSM se describe las propiedades cinéticas de la enzima fosfatasa ácida de bajo peso molecular (fosfohidrolasa de ésteres ortofosfóricos E.C. 3.1.3.2), de hígados de alpaca, bovino y porcino. Las fosfatasas ácidas son enzimas que en pH ácido (aproximadamente 5,0) tienen la propiedad de catalizar la hidrólisis de fosfomonoésteres, liberando como productos de la reacción fosfato inorgánico y un alcohol, cuya naturaleza depende del sustrato utilizado.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y Equipos

- Homogenizador de tejidos

- Espectrofotómetro

- Vortex

- Baño María (37ºC)

- Pipetas

- Tubis de ensayo

- Gradillas

Reactivos

- Buffer acetato 0.01M EDTA 0.0001M con pH=5

- Sustrato p-nitrofenilfosfato 0.036M. Preparar sólo la cantidad necesaria para este ensayo disolviendo el reactivo en agua destilada.

- NaOH 1M

Preparación del extracto crudo

1. Pesar 6g. de hígado manteniéndolo sobre hielo

2.

Dejar en baño de hielo durante 10min

En esas condiciones hipo-osmóticas, se rompen los lisosomas que contienen la enzima, la cual queda soluble.

3. Agregar 24mL de buffer acetato y utilizar un homogenizador para permitir la liberación de la enzima a la solución

4. Mantener sobre hielo durante la homogenización

5. Cuando se tenga un preparado homogéneo, centrifugar por 15 minutos, 6000g a 4ºC

6. Separar el sobrenadante y anotar el volumen obtenido, descartar el sedimento

Procedimiento

1. Marcar tres tubos: blanco muestra (BM), muestra (M) y repetición de la muestra (R). Agregar 0.1 de H2O al tubo B.

2. Colocar 2.5mL de buffer acetato

3. Añadir a los 3 tubos 0,2mL de p-nitrofenol fosfato

4. Incubar a los 37ºC por 2 minutos

5. Agregar 0.1mL de extracto crudo a los tubos M y R, con un intervalo de 30 segundos entre tubos. Es necesario controlar el tiempo exacto por tubo desde el momento en que se agrega el extracto crudo.

6. Incubar exactamente por 2 minutos

7. A los dos minutos exactos después de agregar el extracto crudo, añadir 1mL de NaOH a los tubos M yR, manteniendo el intervalo de 30 segundos entre tubos.

8. Agregar 1mL de NaOH al tubo BM

9. Agregar 0.1mL

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