La Adhesión Celular esta regulada por CDK1 durante el ciclo celular

Introduccion

El ciclo celular es un proceso estrechamente regulado que organiza la duplicación del genoma y la distribución precisa del ADN y otros factores en las células hijas después de la mitosis. La progresión a través del ciclo celular está mediada principalmente por miembros de la familia de quinasas dependientes de ciclina (CDK) en asociación con las proteínas ciclinas asociadas (Malumbres, 2014), y la entrada a la mitosis está controlada por la activación del complejo ciclina B-CDK1 (también conocido como factor promotor de la mitosis; Lohka et al., 1988; Labbe et al., 1989; Gautier et al., 1990). La actividad de la ciclina B1-CDK1 está fuertemente regulada a través de varios ciclos de retroalimentación (Lindqvist et al., 2009), y durante G2, la ciclina inactiva B1-CDK1 se mantiene en el citosol después de la fosforilación de CDK1 en Y15 por Wee1 y quinasas relacionadas para prevenir la prematura entrada en la mitosis (Gould y Nurse, 1989; Parker y Piwnica-Worms, 1992). La actividad de la ciclina B1-CDK1 aumenta progresivamente una vez que las células entran en la profase (Gavet and Pines, 2010b), y la ciclina activa B1-CDK1 se traslada al núcleo (Gavet and Pines, 2010a), lo que desencadena varios eventos mitóticos como el redondeo celular. desintegración de la envoltura nuclear, condensación de cromosomas y formación del huso.

Para la mayoría de las células, la progresión del ciclo celular es dependiente del anclaje (Fang et al., 1996; Schulze et al., 1996), requiriendo interacciones célula-ECM a través de receptores transmembrana de integrina y la formación de complejos de adhesión asociados con actina (Zhu et al. , 1996; Renshaw et al., 1997; Roovers et al., 1999; Mettouchi et al., 2001; Welsh et al., 2001; Park et al., 2011). Antes de entrar en la mitosis, los complejos de adhesión se desmontan rápidamente, y las células se retraen de su entorno y redondear para dividir (Cramer y Mitchison, 1997; Yamakita et al., 1999; Maddox y Burridge, 2003; Dao et al., 2009). Este redondeo de células es necesario para la formación precisa del huso y la captura del cromosoma (Carreno et al., 2008; Kunda et al., 2008; Kunda and Baum, 2009; Lancaster et al., 2013). Además, se requiere una adhesión mediada por integrinas para determinar la orientación de la división celular (Théry et al., 2005) y para que ocurra una citocinesis eficiente (Aszodi et al., 2003; Reverte et al., 2006; Pellinen et al. , 2008; Högnäs et al., 2012; Mathew et al., 2014). Sin embargo, el mecanismo molecular que acopla la maquinaria del ciclo celular a la regulación de la adhesión celular a través de complejos de adhesión asociados a la integración es desconocido.

En este estudio, demostramos que la regulación de los complejos de adhesión y la remodelación del citoesqueleto de actina se producen de manera dependiente del ciclo celular. Cuando las células pasaron de G1 a S, observamos un aumento dependiente de CDK1 en el área compleja de adhesión mediada en parte a través de la fosforilación de la formina FMNL2. Al entrar en G2, el área del complejo de adhesión disminuyó y la actina se distribuyó más periféricamente. La pérdida de complejos de adhesión en G2 fue mediada por el aumento de los niveles de ciclina B1 y la posterior inhibición de CDK1 por Wee1. Se requirió la remodelación de los complejos de adhesión para que las células se redondearan posteriormente y experimentaran una mitosis eficiente porque la prevención de los cambios dio como resultado un aumento de las mitosis fallidas y la multinucleación. En conjunto, estos datos demuestran que la inhibición de CDK1 es el desencadenante que inicia la remodelación de la adhesión en preparación para la entrada en la mitosis y revela un vínculo íntimo entre la maquinaria del ciclo celular y la adhesión celular-ECM.

Resultados

Los complejos de adhesión se modifican de manera dependiente del ciclo celular.

Inicialmente, realizamos una caracterización detallada de los cambios.

En arquitectura de adhesión compleja que tiene lugar a lo largo del ciclo celular. Para este propósito, las células HeLa se sincronizaron mediante un bloqueo de timidina doble, liberadas del bloque para varios puntos de tiempo que reflejan la presencia en G1, S y G2 (Fig. S1, A y B), y se fijaron y se tiñeron para paxilina (como marcador de complejos de adhesión) y F-actina. Consistente con S como un período de crecimiento celular, el área del complejo de adhesión por célula aumentó de G1 a S (Fig. 1, A y B; y Fig. S1 C). El patrón de los complejos de adhesión también cambió de una ubicación predominantemente periférica en G1 a sitios que se distribuyeron por todo el cuerpo celular en S (Fig. 1, A y C; y Fig. S1 C). Al entrar en G2, el área del complejo de adhesión disminuyó (Fig. 1, A y B; y Fig. S1 C), y la distribución volvió al patrón periférico observado en G1 (Fig. 1, A y C; y Fig. S1 DO). El citoesqueleto de actina se modificó concomitantemente con los cambios observados en los complejos de adhesión: en G1 y G2, la actina F se encontró predominantemente en la periferia celular, mientras que las células en S exhibieron fibras de estrés que abarcaban el centro (Fig. 1 A y S1). DO). También se hicieron observaciones similares cuando se utilizó vinculina como marcador alternativo de complejos de adhesión (Fig. S1 D) y en células U2OS sincronizadas (Fig. S1 E). Además, la disminución en el área del complejo de adhesión observada en G2 se confirmó en el análisis de células vivas de células que coexpresan GFP-paxilina y mTurq2-tallo-proteína de unión 18-126 (SLBP18-126). La degradación de mTurq2-SLBP18–126 se produce al final de S (Bajar et al., 2016) y, por lo tanto, se puede utilizar como marcador para la entrada en G2. Consistente con las observaciones hechas en celdas fijas, el área del complejo de adhesión disminuyó progresivamente a medida que las celdas progresaron a través de G2 (Fig. 1, D – F; y Video 1). Por lo tanto, estas observaciones definen la modificación dependiente del ciclo celular de los complejos de adhesión y el citoesqueleto y resaltan la remodelación típica que tiene lugar en la preparación para ingresar a la mitosis. Sin embargo, en lugar del desmontaje del complejo de adhesión inmediatamente después del inicio de la mitosis, como se supone actualmente por el rápido redondeo que se produce en M, estos datos indican que una remodelación inicial de los complejos de adhesión y el citoesqueleto se desencadenó antes, durante G2.

Determinar la relevancia funcional del ciclo celular dependiente.

la remodelación de la adhesión en G2, ya sea la fibra de estrés de la actina o el desensamblado del complejo de adhesión en G2, se eliminó mediante el tratamiento de las células G1 con un activador RhoA (CN03), que evita la hidrólisis de RhoA-GTP y bloquea RhoA en un estado activo, o manganeso, que hiperactiva las integrinas (Fig. S1 E; Mold et al., 1995, 2002). Ambos enfoques inhibieron el redondeo celular (Fig. 1 G y los Videos 2, 3 y 4), sin suprimir la progresión del ciclo celular en G2 (Fig. S1 F), y disminuyeron en gran medida la capacidad de aquellas células que se redondearon para someterse exitosamente división celular (Fig. 1 H y Vidós 2, 3 y 4). Ambos tratamientos también provocaron un aumento en el número de células hijas multinucleadas (Fig. 1, I y J). Estos datos demuestran que la modificación controlada de cualquiera de las células: la adhesión de ECM o el citoesqueleto de actina en G2 es esencial para permitir que las células pasen por la mitosis con precisión y eso, de acuerdo con las observaciones previas (Dao et al., 2009; Lancaster et al., 2013 ; Marchesi et al., 2014), manipulaciones que impiden la adherencia

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