La proteína C aumenta la proliferación celular en células de cáncer colorrectal debido a los dominios LIM

La proteína C aumenta la proliferación celular en células de cáncer colorrectal debido a los dominios LIM

Bien, para evaluar si las variaciones en los niveles de la proteína C afectan a la proliferación celular, sugerimos que tendríamos que realizar cultivos celulares de tejido de muestras del tumor y un cultivo de células del tejido de un colon sano. Una vez teniendo una cantidad de muestras significativas en ambos cultivos, podemos realizar la cuantificación de la proteína C en ambas muestras siguiendo los experimentos anteriores, recordando la importancia de homogeneizar las muestras y llevarlas a la centrifugadora, para obtener el sobrenadante de las proteínas. Cuantificamos las proteínas como en el objetivo anterior (con Western Blot para detectar nuestra proteína C) y anotamos nuestros resultados, procederemos a realizar un subcultivo de ambas muestras para después realizar un marcaje acumulado con análogos de timidina, en el que necesitamos obtener el análogo (BrdU) e incorporarlo con una micropipeta en el medio para que las células (tanto en sanas y cancerosas) se marquen las células en fase S, además se toma una muestra de ambos cultivos (mientras que se dejan otras tantas para que sigan su ciclo), se deja pasar una cantidad determinada de tiempo (quizás 2 hrs) y volvemos a realizar un marcaje con BrdU, se marcan las células que no se marcaron antes, y nuevamente se obtiene una muestra de ambos cultivos y se realiza otro marcaje con BrdU, hasta poder observar que todas las células estén marcadas y obtenemos la proporción de las células que están proliferando, y se comparan los datos con ambos cultivos para conocer si la proteína C aumenta la proliferación celular.

Sin embargo, para tener datos más concisos y contundentes, podríamos tomar las líneas celulares comerciales (CRC y FHC) y realizar edición genómica. En este caso podríamos usar CRISPR/Cas9 para inhibir el gen que produce la proteína C en las células CRC y observar si eso afecta su proliferación, en la que considero que podría haber menos proliferación si se logra inhibir la proteína C, en el que necesitamos un sitio PAM que esté cerca de la secuencia blanco que vamos a modificar y buscar a través de sitios con predictores que nos sugieren qué guías podemos usar, además necesitamos generar una guía de RNA en el laboratorio, tener proteínas Cas (que se van a dirigir a nuestra guía de RNA para hacer el corte en sitios específicos del DNA que codifican a la proteína C) para introducirla dependerá si la tenemos purificada o la introduciremos a través de un plásmido, un DNA de reparación que elimine el gen completo, puede ser también introducido por un plásmido. 

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