Laboratorio de proteínas

Introducción

Las proteínas son las macromoléculas biológicas más abundantes y están presentes en todas las células y en todas las partes de la célula.

Las proteínas desempeñan múltiples funciones de importancia crucial. Una red de proteína interna, el citoesqueleto, mantiene la forma y la integridad física celulares. Filamentos de actina y miosina forman la maquinaria contráctil del músculo. La hemoglobina transporta oxígeno, mientras que los anticuerpos circulantes descubren invasores extraños. Las enzimas catalizan reacciones que generan energía, sintetizan biomoléculas y las degradan, replican genes y los transcriben. Los receptores permiten a las células detectar hormonas y otros indicios ambientales, así como mostrar respuesta a los mismos. (Murray, y otros, 2010)

Las proteínas son polímeros de aminoácidos, en los que cada residuo aminoácido (la parte que queda después de perder los elementos del agua, un átomo de hidrógeno de su grupo amino y el hidroxilo de su grupo carboxilo) está unido al siguiente a través de un tipo específico de enlace covalente, este enlace se forma por la eliminación del agua.  Las proteínas de todos los organismos, desde las bacterias más simples al ser humano, están construidas a partir del mismo conjunto de 20 aminoácidos estándar, también existen otros aminoácidos (no proteicos), como también hay aminoácidos modificados.  Los 20 aminoácidos estándar encontrados en las proteínas son - aminoácidos, todos tienen un grupo carboxilo y un grupo amino unidos al mismo átomo de carbono (carbono ), y difieren en las cadenas laterales. (Lehninger, Cox, & Nelson, 2014) [pic 3][pic 1][pic 2]

                                    Figura 1 Aminoácido generalizado, que forma un zwitterion a pH neutro. (Lehninger, Cox, & Nelson, 2014)

Cada proteína, en su estado nativo, tiene una forma tridimensional característica que es conocida como su conformación o estructura nativa, el mantenimiento de esta estructura es fundamental para el buen funcionamiento de la proteína, y una pérdida de esta conformación implica una alteración en sus funciones. A esta pérdida de la estructura tridimensional de la proteína, se le conoce como desnaturalización, el cual se basa en el uso de agentes físicos, químicos y biológicos.

Para identificar las proteínas o algunos residuos de aminoácidos que estas contengan se usan una serie de pruebas químicas cualitativas, algunas de ellas son:

Prueba de Solubilidad y desnaturalización

La prueba es una propiedad físico-química de las proteínas y aminoácidos que depende del pH, su peso molecular, su carga eléctrica neta y de su conformación en el caso de proteínas (primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria).

En el caso de la solubilidad, es afectado por factores como el pH, sales, temperatura y solventes orgánicos, metales, etc.

En caso, de la desnaturalización de las proteínas, esto se basa en la adición de agentes desnaturalizantes que provocan la precipitación de la proteína, es usado para el aislamiento y purificación de la proteína.

Punto isoeléctrico

El P.I.E. de una proteína es el pH en el cual la molécula es eléctricamente neutra (carga neta cero). La mayoría de las proteínas muestran una baja solubilidad en su punto isoeléctrico, pero aumenta con un incremento de la acidez y alcalinidad.

Si una proteína se carga con una carga negativa (pH alto), las moléculas negativas se repelen entre sí y por lo tanto, permanecen en solución y no precipitan. En cambio cuando las moléculas son neutrales en el P.I.E,  precipitan debido a la ausencia de fuerzas de repulsión y al peso molecular alto de la proteína. De igual modo sucede cuando la proteína se carga positivamente (a pH bajo), por ello permanece en solución y no precipita

Prueba de Biuret

Es una prueba general para polipéptidos y proteínas, ya que sirve para reconocer las uniones peptídicas (dos o más enlaces). La positividad se manifiesta por la aparición de una coloración violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los cationes cúpricos en medio alcalino con las uniones peptídicas. La prueba es semicuantitativa, ya que la  intensidad de color depende de la cantidad de enlaces peptídicos presentes.

Prueba Xantoprotéica

Es una prueba específica que reconoce los aminoácidos que poseen el grupo bencénico (tirosina, fenilalanina, triptófano). Las proteínas que tienen en su composición estos aminoácidos también darán positivo. La prueba es positiva cuando de la aparición de un color amarillo, que es debido a la formación de nitrocompuestos por la reacción del ácido nítrico sobre los grupos bencénicos. Posteriormente se da un viraje a color naranja ya que se obtienen las sales respectivas por la acción del medio alcalino (NaOH).

Prueba de aminoácidos azufrados  

Es una prueba específica, con el cual se puede identificar aminoácidos que contengan azufre en su estructura (por ejemplo cisteína o metionina). Se considera la reacción positiva cuando se obtiene un precipitado color negro. (Nieto, 2021)

Objetivos

Objetivo general

• Desarrollar los conceptos teóricos con respecto a las proteínas, residuos de aminoácidos y aprender una serie de métodos cualitativos para la identificación de proteínas y aminoácidos.

Objetivo específico

• Reconocer los factores que influyen en la solubilidad de las proteínas.
• Comprobar la desnaturalización de la albúmina por efecto de solventes orgánicos, calor y presencia de metales.
• Extraer la caseína de la muestra (leche).
• Detallar el procedimiento de la prueba de Biuret y su aplicación.
• Establecer las diferencias entre las pruebas específicas para aminoácidos (prueba xantoproteica y prueba de aminoácidos azufrados).

Diagrama De Flujo

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Parte Experimental

Materiales y reactivos

Seguridad en el laboratorio

Tener en cuenta los pictogramas de los reactivos a utilizar:

Procedimiento

Propiedades físico-químicas de las proteínas

•  Preparar 06 tubos de ensayo y se rotula del 1 al 6 respectivamente.
• A cada tubo de ensayo se adiciona 2 ml  de:

(1) agua destilada

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