METODOS LAL

Existen 3 variaciones básicas del ensayo del LAL en el mercado: método de gelificación o gel-clot, turbidimétricos y cromogénicos. Cada fabricante de juegos de reactivos describe su propia metodología, pero en general la diferencia entre los protocolos es pequeña.24 La correlación entre los métodos se basa en comparar la menor dilución de un producto dado a la cual se elimina la interferencia. En general, existe una correlación moderada entre los métodos cuando el reactivo LAL es producido por el mismo fabricante e incluso mejor si es del mismo lote, mientras que puede ser muy diferente hasta para el mismo método cuando el reactivo se produce por distintos fabricantes.28 Es por esto que uno de los aspectos críticos es la validación del ensayo, con lo cual se garantiza independientemente del método o lote que a una dilución determinada del producto no existan interferencias y por lo tanto, sea confiable la cuantificación de endotoxinas en dicha muestra. Aún subsisten confusiones con respecto a la validación del método, hay que puntualizar que lo que se valida es la muestra o su dilución, no se trata, por ejemplo, de realizar ensayos de linealidad, exactitud o precisión como se describe para la mayoría de los métodos analíticos. La validación del LAL se presenta en detalle en la guía de la FDA.29 Además, para el lector interesado en este aspecto existe literatura donde se suministra información para ejecutar la validación de un producto empleando el método del LAL.27,30-32

Método de gelificación o gel-clot. El método de gel-clot es el ensayo clásico y el más elemental entre los métodos del LAL. La reacción desarrollada en el tubo de ensayo es esencialmente la misma que ocurre in vivo en la hemolinfa del cangrejo herradura frente a las endotoxinas. Es el ensayo menos susceptible a inhibición y requiere de un equipamiento más sencillo y menos costoso.28

La presencia de endotoxinas es determinada por la formación de un gel o coágulo insoluble.10,33 Se puede desarrollar de forma cuantitativa o semicuantitativa (ensayo límite). Produce resultados binarios, positivo (+) o negativo (-). Un tubo es positivo cuando el gel permanece intacto después de que se invierte cuidadosamente un ángulo de 180 º, cualquier otra condición es interpretada como negativa.16,28 El alcance del método está limitado únicamente por la sensibilidad del lisado. El mercado oferta reactivos para gel-clot con sensibilidades de 0,03; 0,06 y 0,12 UE/mL (unidades de endotóxinas por mililitro). Con este método no se podrán cuantificar endotoxinas por debajo del nivel (sensibilidad) al cual se forma un gel sólido.

Métodos turbidimétricos. Estos métodos se fundamentan por el aumento de la turbidez en la mezcla de reacción provocado por el incremento de la concentración de coagulina insoluble, la cual se monitorea espectrofotométricamente. La proporción del aumento de turbidez está relacionada con la concentración de endotoxinas en la muestra. Los métodos turbidimétricos son los más sensibles, capaces de detectar hasta 0,001 UE/mL.28 Existen 2 variaciones del método turbidimétrico:

Turbidimétrico de punto final: Este método fue comercializado por primera vez por Worthington Inc. (está compañía ya no está en el mercado del LAL) y se emplea raramente en la actualidad.24 El principal inconveniente de este ensayo es que requiere un tiempo de incubación y lectura controlado muy cuidadoso, la reacción no se detiene y por lo tanto el desarrollo de turbidez continúa. Las muestras podrán leerse a un tiempo fijo y solo una vez.28

Turbidimétrico cinético: Levin y Bang en 1968 fueron los primeros en proponer un método turbidimétrico cinético para la determinación de endotoxinas con el empleo del reactivo LAL.4 Inicialmente este método era poco empleado debido probablemente a la carencia de equipos capaces de manipular varias muestras al mismo tiempo.34 Se necesitaron varias modificaciones con la finalidad de simplificarlo y elevar su sentido práctico: 1) el empleo de un lector de microplacas de alta resolución dotado de un incubador a 37 ºC, 2) el uso de un software acoplado mediante una interfase a una computadora para la adquisición y procesamiento de los datos y, 3) la disponibilidad de una formulación del lisado o reactivo LAL más sensible.35

El método turbidimétrico cinético posee el más amplio rango de detección entre los métodos conocidos (0,00-100 UE/mL).

Su principal desventaja es que requiere de un equipamiento costoso y de un personal lo suficientemente calificado para el manejo de equipos y el procesamiento de los datos.28

Existen ofertas en el mercado de equipos que automatizan el uso del método, como son el LAL-5000 Serie 2 de Associates of Cape Cod Inc,36 el Toxinometer ET-201,37 y el QCL-1000® de BioWhittaker

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