Metodología de aislamiento de cepas de Ustilago maydis

Aislamiento de Teliosporas de U maydis.

Los tumores individuales se colectaron en campo, en una campana de flujo laminar se disgregaron con una aguja de disección eliminando hasta donde sea posible la capa fina que las cubre, las teliosporas aisladas de tumores individuales se colocaron en tubos Falcon de 250 mL.

Germinación de teliosporas

1. Se pesa 0.01 g de teliosporas que se colocan en un tubo eppendorf con capacidad de 2 a 3 mL.
2. Agregar un mL al tubo con teliosporas de una solución de cloro al 5% en invertir 3 veces y decantar de inmediato para evitar ruptura de teliosporas.
3. Se coloca un mililitro de agua  destilada y una gota de Tween 20.
4. Se agita por inmersión  hasta que las teliosporas se distribuyan en el medio.
5. Para cada tumor a evaluar se colocan 10 tubos con 900 µL de agua destilada.
6. Del tubo donde se encuentran las teliosporas  se toman 100 µL y se colocan en el primer tubo de 900 µL  y de este 100 µL para el siguiente y así sucesivamente hasta llegar a la dilución 10-10.
7. Observar las diluciones en la cámara de Neubauer hasta observar 1 o 2 teliosporas  en cada uno de los cuadrantes de la cámara. Una vez observado esto se siembran tres diluciones a la posterior observada.
8. De cada dilución se siembran en cajas Petri con PDA 50 µL en tres repeticiones mínimo.
9. Las cajas se incuban a 240C por 24 h cuando se detecta el inicio de la germinación de teliosporas (12 h) individuales en alguna caja con determinada dilución. (las diluciones  a la 10-6 y 10-7 son las más probables en encontrar teliosporas individuales en germinación).
10. Muy importante es la identificación de las cepas en cada una de las cajas de Petri.

Material

Teliosporas de U. maydis

Balanza analítica

11 tubos eppendorf

Tween 20

Solución de cloro al 5%

Micropipetas de 1000, 100 y µL

Cámara de Neubauer

9 cajas de Petri con medio PDA sólido

Incubadora a 240C

Obtención de cepas

1. Las esporidias, producto de la germinación de una teliospora individual en un tiempo de 12 h se colocan en un tubo Eppendorf con capacidad de 2 a 3 mL que contenga 1 mL de agua. Se coloca una gota de Tween 20 y se agita por inmersión hasta que se dispersen las esporidias en el medio.
2. La dilución se observa en una cámara Neubauer como en las teliosporas, si observa 1 o 2 esporidias en cada uno de los cuadrantes de la cámara se siembran tres diluciones  y una posterior a la observada.
3. La siembran se realiza en cajas Petri con PDA con 50 µL de la dilución en tres repeticiones mínimo.
4. Las cajas se incuban a 240C por 24 h.
5. Revisar y las esporidias individuales resembrarlas 2 o tres veces cada tercer día.

Preparación de medio de cultivo PDA para U. maydis (750 mL).

1. En un matraz de un litro.

1. Colocar 500 mL de agua destilada.
2. Agregar 0.3 g de Dextrosa, agitar hasta disolver.
3. Agregar 28 g de PDA, agitar hasta disolver.
4. Agregar 1.5 g de agar, agitar hasta disolver.
5. Agregar 250 mL  de agua destilada y agitar hasta disolver.

1. En un tubo Eppendorf colocar 1 mL de agua y 1/2 capsula de penicilina, agitar para disolver (una capsula de penicilina contiene aproximadamente 5 g, usar la mitad para 750 mL de medio).
2. Sellar la boca del matraz  con papel aluminio  y con gasa  para evitar derrame durante la esterilización.
3. Esterilizar el medio durante 15 min a 1210C y 15 lb/in2.
4. Agregar el sobrenadante de la solución de penicilina cuando el matraz se encuentre  aproximadamente  entre 30 y 400C y vaciar en cajas Petri en la campana de flujo laminar.

a)        En un matraz de un litro.

1.        Colocar 500 mL de agua destilada.

2.        Agregar 0.3 g de Dextrosa, agitar hasta disolver.

3.        Agregar 28 g de PDA, agitar hasta disolver.

4.        Agregar 1.5 g de agar, agitar hasta disolver.

5.        PDA con 1% de carbón (agregar 7.5 g de carbón activado) solo para reacción Fuzzy. Agitar hasta disolver.

6.        Agregar 250 mL  de agua destilada y agitar hasta disolver.

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