Metodologías de extracción de ADN

Metodologías de extracción de ADN

Artículo 1:

Materiales

• 100 mg de tejido vegetal
• Nitrógeno líquido: Evita que las DNasas fragmenten el ADN
• Buffer CTAB 2X: Elimina inhibidores que pueden afectar la PCR y procesa tejidos ricos en polisacáridos y polifenoles para aislar el ADN de estos.
• RNAsa A: Purificación de ADN
• Proteinasa K: Purificación de ADN
• Fenol: Separación de fase acuosa y fase orgánica
• Cloroformo: Separación de fase acuosa y fase orgánica
• Alcohol isoamílico: Separación de fase acuosa y fase orgánica
• Acetato de amonio: Mantiene el pH constante y puede ser utilizado para amortiguar fases móviles para HPLC
• Isopropanol: Concentrar el material genético con baja pureza
• Etanol: Concentrar el material genético con buena pureza
• Buffer TE 1X: Solubiliza ácidos nucleicos y evita se degradación

Metodología:

1. Se agrega nitrógeno líquido al tejido vegetal y se procede a pulverizarlo.
2. Se añade 1 ml de buffer CTAB 2X, el cual debe ser calentado previamente a 55°C, y el tejido pulverizado a un tubo para microcentrífuga de 1.5 ml.
3. A temperatura ambiente, se mezcla por inversión e incuba durante 5 minutos.
4. Se procede a incubar 5 minutos más en hielo.
5. Se agregan 20 µl de RNAsa A, se mezcla por inversión y se incuba durante 20 minutos a una temperatura de 37°C invirtiendo los tubos de dos a tres veces durante dicho tiempo.
6. Se agregan 10 µl de proteinasa K y se mezcla por inversión e incuba durante 20 minutos a 60°C invirtiendo de dos a tres veces durante el tiempo especificado.
7. Se procede a incubar en hielo durante 5 minutos.
8. Se agregan 600 µl de solución de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico en proporciones 25:24:1 respectivamente y se agita por inversión.
9. Se procede a centrifugar a 10,000 rpm durante 12 minutos a 8°C.
10. Se recuperan 200 µl del sobrenadante y se colocan en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml.
11. Se agregan 50 µl de actetato de amonio a 10M y se mezcla por inversión suficientes veces.
12. Se agregan 500 µl de isopropanol a -20°C de temperatura y se mezcla por inversión suficientes veces.
13. Durante 2 horas, mantener la mezcla a -20°C.
14. Proceder a centrifugar a 10,500 rpm durante 5 minutos a 8°C.
15. Se elimina con cuidado el sobrenadante.
16. Se agrega 1 ml de etanol 70% a -20°C.
17. Se mezcla por inversión hasta que el botón de ADN se desprenda del microtubo.
18. Se deja reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
19. Nuevamente se introduce en la centrifugadora a 10,000 rpm por 5 minutos a 8°C.
20. Se elimina el sobrenadante.
21. Dejar los tubos abiertos hasta que el etanol se evapore.
22. Rehidratar el botón de ADN con 200 µl de buffer TE 1X.

Artículo 2: ÁCIDOS NUCLEICOS

Materiaes:

• Buffer TE: Solubiliza ácidos nucleicos y evita se degradación.
• Dodecil sulfato de sodio 10% (SDS): lisis celular
• Proteinasa K: Purificación de ADN.
• NaCl 5M: Precipita el material genético disuelto en alcohol.
• Solución CTAB/NaCl: Elimina inhibidores que pueden afectar la PCR y procesa tejidos ricos en polisacáridos y polifenoles para aislar el ADN de estos.
• Solución cloroformo/alcohol isoamílico: Remueve los complejos formados de CTAB, proteínas y polisacáridos.
• Solución cloroformo/alcohol isoamílico/fenol: Separación de fase acuosa y fase orgánica.
• Isopropanol: Concentrar el material genético con baja pureza.

• Etanol 70%: Concentrar el material genético con buena pureza.

Metodología:

1. Se inoculan 5 ml de medio de cultivo con una cepa bacteriana de interés y se deja crecer hasta saturar el cultivo.
2. Se centrifuga 1.5 ml del cultivo durante 2 minutos y se descarta el sobrenadante al terminar.
3. Se vuelve a suspender el botón con 567 µl de buffer TE, se agregan 30 µl de SDS a 10%  más 3 µl de proteinasa K (20 mg/ml) y se mezcla por inversión suavemente. Posterior a esto se incuba durante 1 hora a 37°C.
4. Se agregan 100 µl de NaCl 5 M y se mezcla por inversión.
5. Se agregan 80 µl de la solución de CTAB y NaCl y se mezcla por inversión durante 10 minutos a 65°C.
6. Se agrega un volumen de solución de cloroformo/alcohol isoamílico, se mezcla por inversión y se centrifuga durante 5 minutos.
7. Se traslada la fase acuosa a un tubo eppendoff, se agrega 1 volumen de solución de cloroformo/alcohol isoamílico/fenol, se mezcla por inversión y se centrifuga durante 5 minutos.
8. Se transfiere el sobrenadante a otro tubo, se agregan 0.6 volumenes de isopropanol, se agita el tubo y se centrifuga.
9. Se lava el ADN con etanol 70%.
10. Se disuelve el botón en 50 µl de buffer TE.
11. Se calienta a 55°C durante 10 minutos para suspender el botón nuevamente pipeteando varias veces.

Bibliografia

Alejos Velázquez L. P., Aragón Martínez M. C. y Cornejo Romero A.. (s.f.). Extracción y purificación de ADN. 26 de agosto 2020, de Instituto Nacional de Ecología y cambio climático Sitio web: http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf

Ciochinni A. y Niemirowicz G.. (s.f.). ÁCIDOS NUCLEICOS. 26 agosto 2020, de Universidad Nacional de San Martin Sitio web: http://www.iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatura/biotecnologia/2018/QuimicaBiol/1527862563.pdf

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