Métodos basados en dedos de zinc

Resumen del artículo: Métodos basados ​​en ZFN, TALEN y CRISPR / Cas para la ingeniería del genoma

La edición del genoma se basa en el uso de nucleasas diseñadas, compuestas de dominios de unión a secuencias específicas de ADN fusionados a un módulo de escisión de ADN no específico. Dichas nucleasas permiten modificaciones genéticas eficientes y precisas al inducir roturas de doble hebra de ADN (DSB) que estimulan los mecanismos de reparación del ADN celular, incluida la unión de extremos no homólogos propensa a errores (NHEJ) y la reparación dirigida por homología (HDR). Con nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) se puede personalizar el dominio de unión al ADN, combinar con numerosos dominios efectores para afectar la estructura y función genómicas, incluidas nucleasas, activadores y represores de la transcripción, recombinasas, metiltransferasas de ADN e histonas e histonas acetiltransferasas.

Los TALE son proteínas naturales del género de bacterias fitopatógenas Xanthomonas y contienen dominios de unión al ADN, compuestos por una serie de dominios repetidos de 33 a 35 aminoácidos, cada uno de los cuales reconoce un solo par de bases. La especificidad de TALE está determinada por dos aminoácidos hipervariables que se conocen como di-residuos de repetición variable (RVD).

Las nucleasas específicas de sitio facilitan la HDR, permiten la generación rápida de líneas celulares y organismos con fenotipos nulos. Las roturas de doble hebra de ADN inducidas por nucleasa (DSB) pueden repararse mediante reparación homóloga dirigida (HDR) o unión de extremos no homólogos propensa a errores (NHEJ). En presencia de un plásmido donante con brazos de homología extendidos, la HDR puede conducir a la introducción de transgenes únicos o múltiples para corregir o reemplazar genes existentes. En ausencia del plásmido donante, la reparación mediada por NHEJ produce pequeñas mutaciones de inserción o deleción en la diana que causan la alteración del gen. En presencia de oligonucleótidos bicatenarios o plásmido donante linealizado in vivo, se han insertado fragmentos de ADN de hasta 14 kb mediante ligación mediada por NHEJ. La inducción simultánea de dos DSB puede provocar deleciones, inversiones y translocaciones del segmento intermedio. Para optimizar la especificidad de escisión y reducir la toxicidad se han generado heterodímeros de ZFN y TALEN, por ejemplo, una variante hiperactivada del dominio de escisión de FokI, que exhibe una actividad de escisión 15 veces mayor en comparación con las ZFN tradicionales.

La entrega directa de proteínas ZFN purificadas en las células no conlleva el riesgo de mutagénesis de inserción y conduce a menos efectos fuera del objetivo. En las bacterias, el sistema CRISPR proporciona inmunidad adquirida contra la invasión de ADN extraño mediante la escisión de ADN guiada por ARN. En el sistema CRISPR / Cas de tipo II, los segmentos cortos de ADN extraño, denominados "espaciadores", se integran dentro de los loci genómicos CRISPR y se transcriben y procesan en ARN CRISPR corto (ARNcr). Estos crRNA se aparean para transactivar crRNA (tracrRNA) y escisión directa de secuencia específica y silenciamiento del ADN patógeno por las proteínas Cas. El reconocimiento de la diana por la proteína Cas9 requiere una secuencia "SEED" dentro del crRNA y una secuencia conservada del motivo adyacente del protoespaciador que contiene dinucleótidos (PAM) corriente arriba de la región de unión del crRNA.

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