Objetivo: Transferir el gen marcador de resistencia al antibiótico Tetraciclina y el gen que codifica para la expresión de la proteína verde fluorescente entre dos cepas de E. coli.

Laboratorio  N° 8: Genética bacteriana

Protocolo de Conjugación Bacteriana

Objetivo: Transferir el gen marcador de resistencia al antibiótico Tetraciclina y el gen que codifica para la expresión de la proteína verde fluorescente entre dos cepas de E. coli.

Cepas utilizadas

- Donora: E. coli  S17-1: portador del plásmido pMP 6 que contiene el gen para la expresión de la proteína verde fluorescente (gfp+) y es tetraciclina resistente, kanamicina sensible (tetR, kmS)

- Aceptora: E. coli SM10: gfp-, tetS, kmR

Protocolo del ensayo

1- Preparar 5 ml de un cultivo de 20 horas a 37ºC con agitación de las cepas donora  y aceptora en caldo LB adicionado del antibiótico respectivo (tetraciclina 6 µg/ml, kanamicina 25 µg/ml).  

2- A partir de los cultivos inocular 400µl en 10 ml de caldo LB con el antibiótico correspondiente y crecer a 37ºC con agitación hasta fase log (aprox. 3 horas).

3- Preparar en tres tubos eppendorff las mezclas descriptas en la siguiente tabla. Centrifugar a 6000 rpm durante 5 min.

                                                                     Tubo

4- Descartar el sobrenadante para eliminar el antibiótico y resuspender en 50 µl de LB.

5- Plaquear los 50 µl de cada mezcla (1, 2, 3) en el centro de placas (botón) conteniendo agar LB sin antibiótico y crecer 24 - 48 horas a 37ªC.

6- Adicionar a la superficie de cada placa 1 ml de caldo LB sin antibiótico y transferir a un tubo eppendorff.

7- Determinar la concentración de transconjugantes: a partir de la mezcla del tubo 1 y sus diluciones sembrar 100 µl (dilución final -1, -2 y -3) en agar LB con tetraciclina (6 µg/ml) y kanamicina (25 µg/ml), esparcir con espátula de vidrio.

8  - Sembrar como controles negativos 100 µl del tubo 2 y 3 en LB con ambos antibióticos.

9 - Determinar el número inicial de ufc/ml de E. coli tets-kmr (tubo 3): realizar diluciones en solución fisiológica y sembrar (dil final -6, -7 y -8) con espátula de vidrio en LB con kanamicina.  Incubar 24 horas a 37ªC.

8-  Determinar la frecuencia de conjugación.

Transformación Bacteriana

Objetivo: Transferir el plásmido pHKT3, portador de la secuencia que codifica para la proteína rojo fluorescente (rfp) y del gen marcador para la resistencia a tetraciclina, a una cepa de Escherichia coli sensible a tetraciclina y rfp negativa.

Protocolo del ensayo:

1- Disponer de células de E coli  competentes.

2- Descongelar 100 µl de bacterias competentes y agregar 2µl del plásmido, dejar las células 30min en contacto con el plásmido.

3- Calentar 1 min a 42° C y colocar inmediatamente en hielo durante 1 minuto.

4- Agregar 1 ml de caldo LB e incubar 1 hora a 37° C.

5- Centrifugar a baja velocidad la mezcla de transformación y descartar la mayor parte del sobrenadante de modo de conservar aproximadamente 100ul.

 6- Sembrar sobre placas con agar LB + Tetraciclina (10ug/ml), toda la mezcla de transformación.

7- Incubar las placas durante 24 hs a 37°C.

8- Analizar la presencia de bacterias resistentes y fluorescencia roja.

                Cálculo de Eficiencia de Transformación: Nº de colonias transformantes obtenidas

                                                                                 cantidad de ADN utilizado (μg DNA)

Esquema del plásmido utilizado

[pic 1]

1- Mencione y explique brevemente cuáles son los mecanismos de transferencia de material genético en bacterias.

2-  ¿En que se diferencian  las cepas F+, Hfr y F- y cuál es su función en la conjugación?

3- a. Diferencie y describa los siguientes procesos de conjugación: F+× F- y Hfr × F-.

    b. Distinga la transferencia de F+ y Hfr con respecto a la cantidad de material genético transferido y la integridad de la unidad transferida.

4- En qué consiste la conjugación F’ y en qué se diferencia el plásmido F’ de un plásmido F normal.

5- En el laboratorio se aisló un mutante StrR que es incapaz de crecer con acetato como única fuente de carbono (ace-). Este mutante se conjugó con una cepa Hfr que es StrS- ace+. ¿Cómo seleccionaría los transconjugantes en el experimento? Indique los medios de cultivo utilizados y los controles que realizaría.

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