Observación de células de médula ósea y su concentración en portaobjetos mediante cytospin

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INTRODUCCIÓN

El proceso a través del cual se generan las células de la sangre se denomina hematopoyesis y ocurre bajo condiciones muy especificas en el interior de los huesos, en la llamada medula ósea. La medula ósea es un tejido que se encuentra en el interior de los huesos. (1)

Alrededor del 0.05 - 0.1% de las células de la médula ósea roja derivan de células mesenquimatosas (tejido del cual derivan casi todos los tejidos conectivos) llamadas células madre pluripotenciales (stem cells) o hemocitoblastos. Estas células tienen la capacidad de diferenciarse en diversos tipos celulares. (2)

Las células madre de la medula ósea roja se reproducen, proliferan y se diferencian en células que darán origen a las células de la sangre, macrófagos, células reticulares, mastocitos y adipocitos (Figura 1). [pic 3][pic 4]

OBJETIVO

 Obtener células de medula ósea mediante el uso de cytospin.

Observar células hematopoyéticas en microscopio haciendo uso de la tinción Hematoxilina-Eosina.

MATERIAL Y MÉTODOS

Tabla 1. Material y reactivos^[a] empleados.

PROCEDIMIENTO

En una cámara de gases construido con un vaso de precipitado y colocando algodón empapado con cloroformo se introdujo al ratón dentro de la misma y se tapó con ayuda de un vidrio de reloj. Se notó que la respiración del ratón cada vez era mas acelerada hasta que finalmente dejó de respirar, se observó relajación de esfínteres y perdida de brillo en los ojos, se verificó que el roedor estuviera muerto y se procedió a cortar la pierna del ratón desde la cabeza del fémur, se retiro la piel y el musculo. Se cortó los extremos del hueso y se introdujo la aguja de la jeringa de insulina que contenía solución salina^[b], se hizo un lavado y aspirado del interior del hueso y se colecto la medula ósea en un tubo eppendorf, se centrifugó el tubo ^[c]y con ayuda de una pipeta semiautomática se desechó el sobrenadante quedando solo con el sedimento^[d]. Al sedimento se le agrego 200 µL de solución salina re-suspendiendo el sedimento.

Se prepararon los embudos para la citocentrífuga de acuerdo a las instrucciones del profesor y se ensamblaron dentro de la citocentrífuga.

Se colocaron 20 µL de SFB en cada uno de las cámaras del embudo y se centrifugó brevemente. Se agregaron 100 µL de la muestra en cada una de las cámaras del embudo y se centrifugó en ciclos cortos durante 10 minutos. Se desensambló el embudo cuidadosamente y se dejó secar toda una noche dentro de una caja de preparaciones.

Se tomó portaobjetos con la muestra a analizar y se fijó con el metanol, dicha preparación durante 30 segundos, después se agregó la hematoxilina durante un periodo de 6 minutos. Se retiró con una piseta con agua, así después se enjuagó durante 5 min. en agua destilada en una caja de Coplin realizando 2 cambios de agua. Se retiró de la caja y se le agregó ácido acético al 2% (CH3COOH) durante 20 segundos, se enjuagó con agua destilada durante 5 minutos realizando 3 cambios de agua.

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