PRÁCTICA No. 1 DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE. MÉTODO DE SANGER

PRÁCTICA No. 1

DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE. MÉTODO DE SANGER.

EQUIPO 4                                                                GRUPO: 3FM1

CUELLAR SÁNCHEZ JESÚS ALBERTO                                            RUIZ GONZÁLEZ VERÓNICA      

Fecha de entrega: 22 de agosto del 2019.                 Coordinadora: Pérez Cervantes Hilda.        

INTRODUCCIÓN

Las proteínas tienen diversos propósitos, sin embargo, de no haber sido caracterizadas y con el objetivo de entender su reactividad, así como elucidar su estructura, es vital conocer su secuencia de aminoácidos.

Los primeros esfuerzos para determinar una secuencia proteica datan de 1953, cuando Friedeck Sanger confirmó la estructura de la insulina bovina, decimos que “confirmó” puesto que la secuencia ya había sido descubierta unos años antes. No obstante, con el trabajo de Sanger se estableció que las proteínas tienen enlaces covalentes únicos, dejando atrás la creencia de que eran simples coloides1.

Esta técnica de secuenciamiento utiliza el compuesto, 2,4-dinitrofluorobenceno (DNF) que reacciona con el residuo del N-terminal bajo condiciones alcalinas. El aminoácido derivado se puede hidrolizar y será etiquetado con un grupo dinitrobenceno que imparte un color amarillo al aminoácido.

La separación de los aminoácidos modificados (DNP-derivado) por electroforesis y la comparación con la migración de los estándares del DNP-derivado permite la identificación del aminoácido N-terminal2.

Retomando a la hemoglobina, esta es una proteína de los glóbulos rojos, que transporta gases (CO2 y O2) a través del cuerpo.3 Su contenido en proteína es elevado (superior al 90%) siendo particularmente rico en lisina y valina. Sin embargo, presenta una baja concentración en aminoácidos azufrados e isoleucina.4

En cuanto a sus aplicaciones y resaltando su trascendencia, se sabe que en la medicina esta clase de determinaciones permiten detectar mutaciones en las cadenas proteicas, siendo este tipo de análisis un factor crucial en el diagnóstico de enfermedades causadas por problemas genéticos.

 OBJETIVOS

• Ejecutar correctamente el método de Sanger.
• Interpretar adecuadamente una cromatografía.
• Conocer el fundamento del método de Sanger.
• Comprender la relación que mantienen los reactivos implicados en el método de Sanger.
• Identificar al grupo N-terminal de la hemoglobina bovina.

RESULTADOS:

A continuación, se presentan los Rf y las distancias de las fronteras recorridas por el disolvente en el cromatograma (Anexo 1), se destaca que los cálculos del Rf fueron realizados utilizando la siguiente fórmula:

[pic 3]

Utilizando una fase móvil de ácido cítrico- citrato de sodio, se pusieron de manifiesto en la muestra 3 compuestos, además de los estándares, cuyos Rf fueron:

DISCUSIÓN:

En la muestra problema se presentaron tres compuestos, cuyos Rf fueron reportados en el apartado de Resultados. El primero (Rf = 0.643) se caracterizó como aminoácido Valina, lo anterior se confirma bibliográficamente al relacionarlo con el estándar DNP-Val, observando que tienen Rf bastante similares (0.643 vs 0.702), se sabe que el aminoácido N-terminal de la Hb Bovina es la Valina, presentándose en el cromatograma.

...