Pirosecuenciación

Pirosecuenciación

La pirosecuenciación o secuenciación 454, de 454 Life Sciences, es una tecnología de determinación de secuencia de ADN a gran escala, aplicable a genomas completos, mediante luminiscencia. A diferencia del sistema de Sanger, capaz de resolver 67.000 bases cada hora,1 el método 454 puede determinar la secuencia de 20 millones en 4,5 horas, lo cual abarata enormemente el coste del proceso.2

Índice

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• 1 Fundamento

o 1.1 Luminiscencia

• 2 Procedimiento

• 3 Aplicaciones

• 4 Implicaciones

• 5 Ventajas

• 6 Referencias

• 7 Enlaces externos

Fundamento[editar]

La muestra biológica se carga en una placa «PicoTiterPlate Device», de fibra óptica, que permite transmitir la luz producida por quimioluminiscencia durante la reacción de secuenciación hasta la cámara CCD de captación de imágenes. Dicha placa, en forma de panal, posee multitud de pocillos.

La particularidad es el tamaño del ADN a secuenciar en cada pocillo: debe ser entre a 500 y 1000 nucleótidos. La genoteca de ADN genómico con la cual comenzar la secuenciación se carga en la placa; en ella, cada fragmento se amplifica de forma aislada mediante emPCR o PCR basada en emulsión de modo que se amplifique hasta 10 millones de veces; este incremento facilita la detección de la señal.2

El fundamento de la secuenciación se basa en controlar el flujo secuencial y cíclico de nucleótidos sobre la placa en combinación con un sistema de detección bioluminiscente que permite convertir los productos generados durante la incorporación de nucleótidos (pirofosfato) en luz (por medio de la luciferasa) que es detectable por el dispositivo CCD.

Luminiscencia[editar]

La inyección de los dNTPs en cada pocillo acarrea la interacción con al menos un nucleótido complementario al situado en ese punto del ADN de secuencia desconocida; esto es que para cada punto de la secuencia sólo un dNTP puede ser individualmente unido de forma correcta, y cada vez que esto sucede el establecimiento de un enlace químico provoca la liberación de una molécula de pirofosfato.1

En cada pocillo de la placa PicoTiter se añade, además del ADN molde, la polimerasa que va incorporando las bases complementarias de la secuencia. Al añadirlas, se produce el pirofosfato, el cual mediante la enzima sulfurilasa es transfomado en ATP. Este ATP es cogido por la enzima luciferasa que al unirselo a la luciferina, genera un haz de luz que indica la secuencia para ese punto. Tampoco nos podemos olvidar el papel de la enzima apirasa, esta enzima es la encargada de degradar aquellos nucleótidos que no han sido incorporados y quedan sueltos, con el fin de que al añadir un nuevo dNTP, no existan restos de reacciones anteriores.2

Procedimiento[editar]

• Mediante una emulsión se generan microreactores (microesferas).

• En

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