Protocolo de ensayos de Biología celular y Ultraestructura
Enviado por Lydia Eniith • 23 de Agosto de 2015 • Ensayo • 2.268 Palabras (10 Páginas) • 286 Visitas
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CONTENIDO
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Electroforesis de células individuales (linfocitos) “Ensayo Cometa” [pic 11]
REACTIVOS
Preparación de Agarosa regular al 0.65%
Agar (gr) | Cantidad de agua destilada (mL) |
0.325 | 50 |
0.162 | 25 |
0.13 | 20 |
0.0975 | 15 |
0.065 | 10 |
0.0325 | 5 |
Preparación de laminillas con Agarosa regular al 0.65%
Depositar 140 µL de agarosa regular en un porta objetos limpio (esmerilado) y estender con el ddo indice sobre todo el cubre objetos.
Dejar secar las laminillas en la estufa a 80°C.
Preparación de Agarosa de bajo punto de fusión (LMPA) al 1%
Agar (gr) | Cantidad de agua destilada (mL) |
0.50 | 50 |
0.25 | 25 |
0.20 | 20 |
0.15 | 15 |
0.1 | 10 |
0.05 | 5 |
Solución de lisis 1
(2.5M NaCl, 100mM (0.1M) EDTA, 10% DMSO, 1% Triton) · (100)
Cantidad de agua destilada (mL) | NaCl (gr) | EDTA (gr) | Tris-HCl (gr) |
1000 | 146.44 | 37.02 | 1.20 |
500 | 73.22 | 18.51 | 0.604 |
250 | 36.61 | 9.257 | 0.302 |
150 | 21.96 | 5.55 | 0.181 |
100 | 14.64 | 3.70 | 0.120 |
50 | 7.32 | 1.85 | 0.060 |
25 | 3.36 | 0.92 | 0.030 |
Ajustar pH 10.
Preparación del cöplin
Agregar un volumen de 28 mL (solución de lisis 1 + 2.8 mL de DMSO + 280 µL de Triton). Mantener a 4°C/ 4 h.
Solución de electroforesis
(NaOH 300mM, EDTA 200mM)
Cantidad de agua destilada (mL) | NaOH (gr) | EDTA (gr) |
1000 | 12 | 58.44 |
500 | 6 | 29.22 |
250 | 3 | 14.61 |
150 | 1.8 | 8.766 |
100 | 1.2 | 5.844 |
50 | 0.60 | 2.922 |
25 | 0.30 | 1.461 |
Ajustar pH 13. Mantener a 4°C/ 10 min., en un lugar oscuro.
Realizar electroforesis a 25V y 300mA/ 20 min.
Solución neutralizante
(0.4M Tris-HCl)
Cantidad de agua destilada (mL) | Tris-HCl (gr) |
1000 | 48.456 |
500 | 24.228 |
250 | 12.114 |
150 | 7.286 |
100 | 4.857 |
50 | 2.428 |
25 | 1.214 |
Ajustar pH 7.5. Mantner en refrigeración constante a 4°C.
PROCEDIMIENTO
- Preparar los portaobjetos con agarosa regular al 0.65%, y secar a 85°C.
- Preparar el volumen indicado de agarosa de bajo punto de fusión al 1% a 37°C.
- Pipetear una alicuota de 80µL (20µL de la muestra (rango de concentración celular de la muestra 5 - 10 million mL-1.) + 80µL de LMPA) y depositarla en las laminillas pretratadas al 0.65%.
- Cubrir la muestra depositada con un cubreobjetos.
- Dejar solidificar a 4°C por 4 min.
- Retirar cuidadosamente el cubreobjetos de la laminilla.
- Los portaobjetos son colocados dentro del cöplin con la preparación de lisis, a 4°C/ 24h.
- Posteriormente se raliza una corrida electroforética a 25V y 300mA/20 min, con un tiempo previo de reposo de 20 min.
- Una vez terminada la electroforesis, las laminillas son enjuagadas con agua destilada y solución neutralizante de manerera cuidadosa para asegurar la integridad de la agarosa.
- Finalmente son deshidratadas con metanol puro y se dejan secar al ambiente.
- Una vez secas se procede a la tinción con colorante Gel Green™ agregando un volumen de 35 µL (concentración 0.62 µL/ mL de agua destilada) por laminilla.
- Cubrir con un cubreobjetos y dejar reposar 10 min. en un lugar oscuro.
- Observar en microscopio de fluoresencia.
Electroforesis de células individuales (espermatozoides) “Ensayo Cometa”
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