Práctica 5 Biología Molecular

Discusión:

La idea básica al utilizar la técnica de PCR es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN. Para que se lleve a cabo la PCR se requiere una cadena de ADNg o ADNc que sirva de molde (el cual se obtuvo la práctica pasada), una ARN polimerasa, cofactores necesarios para la actividad correcta de esta, desoxinucleótidos y oligonucleótidos o primers.

La amplificación in vitro de la PCR sigue las mismas reglas de la replicación, cuando llevamos a cabo la técnica simulamos lo que sucede en una célula cuando se sintetiza el ADN, en el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo (Master mix + ADN).

Actualmente el proceso se realiza mediante un termociclador, ya que este es capaz de cambiar la temperatura de la muestra en cuestión de segundos, indispensable para las diferentes reacciones requeridas.

Un ciclo de PCR incluye:

Inicio de la desnaturalización: es necesaria una temperatura de 95 °C para la desnaturalización de la doble cadena de ADN.

Alineación: la temperatura se encuentra en un rango entre 55 y 60 °C en el cual la mayoría de los iniciadores hibridan, dejando el extremo 3’OH disponible y listo para la adición de los nucleótidos consecutivos por la ADN polimerasa.

Extensión: se produce a la temperatura óptima para el funcionamiento de la ADN polimerasa empleada, en el caso de la Taq polimerasa, la más utilizada es 72 °C.

Amplificación final: una vez terminados los ciclos designados para la PCR, la temperatura de extensión se mantiene por 5 minutos, lo que permite que la polimerasa termine la extensión de los productos de los cuales se encuentra unida.

Durante la programación de los ciclos de la PCR se programa también un ciclo final de 4 °C por varias horas, lo que permite conservar los productos de PCR hasta que se retiren los tubos de restricción del equipo.

En cada uno de los ciclos amplificados se duplica la cadena de producto inicial. Así, el producto de PCR aumenta exponencialmente conforme el número de ciclos de PCR. Sin embargo, el producto de PCR depende del número inicial de copias del molde de ADN.

Bibliografía:

ARMENDARIZ, Juan.,BEAS Carlos., ORTUÑO Daniel. BIOLOGIA MOLECULAR. FUNDAMENTOS Y APLICACIONES EN CIENCIAS. (2013). México D.F. McGraw-Hill interamericana.

UNIVERSIDAD POLITECNICA DE VALENCIA. Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR). (2003).

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