Que es la Inmunohistoquímica

INMUNOHISTOQUÍMICA

Diana Carolina Muñoz Jiménez

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INDICE

Presentación …………………………………………………………………….. Pg 4

Objetivos del proyecto ………………………………………………….…. Pg 3

Introducción ……………………………………………………………….. Pg 3

Ac monoclonales y policlonales …………………………………………... Pg 4

• Diferencias entre Ac monoclonales y policlonales.

Técnica ELISA ……………………………………………………………. Pg 6

Proceso previo a la técnica

• Fijación ……………………………………………………………. Pg 8
• Tallado, inclusión y corte …………………………………………. Pg 8

Métodos de recuperación antigénica ……………………………………… Pg 9

Bloqueo de la peroxidasa endógena ………………………………………. Pg 10

Incubación de Ac …………………………………………………………. Pg 11

• Ac primario.
• Ac secundario.

Marcaje de Ac …………………………………………………………….. Pg 12

• Métodos inmunohistoquímicos

• Directo.
• Indirecto

• Peroxidasa Antiperoxidasa.
• Avidina Biotina Peroxidasa (ABC).

• Otras técnicas

• Enzimas.
• Doble marcaje.
• Inmunofluorescencia.

Diaminobencidina (DAB) ………………………………………………….. Pg 14

• Función.
• Uso.
• Ventajas y desventajas.

Contraste ……………………………………………………………………. Pg 16

Sistema manual y automático ………………………………………………. Pg 16

Bibliografía ………………………………………………………………… Pg 18

PRESENTACIÓN.

Diana Carolina Muñoz Jiménez

Técnico superior de Anatomía Patológica del Centro Juan de Mairena, de la familia profesional sanitaria, situado en San Sebastián de los Reyes.

PROYECTO.

Objetivos.

El objetivo principal de esta investigación es detallar el procedimiento que conlleva la obtención de una biopsia, autopsia o material citológico y la aplicación de técnicas inmunohistoquimicas, para su posterior estudio y observación al microscopio, para conocer en que situaciones se requiere un estudio inmunohistoquímico y disponer de esquemas precisos de estudio en el diagnóstico de situaciones frecuentes e inciertas.  

Introducción.

Antes de entrar en la explicación del concepto de inmunohistoquimica, debemos tener en cuenta que el uso de tinciones de tejidos se realizó con el fin de facilitar su observación microscópica, siendo la primera técnica la hematoxilina-eosina en el siglo XIX. Más tarde, en el primer tercio del siglo XX, se introduce la inmunoenzimología que utilizaba tejidos sin fijar y de la que quedan únicamente restos.

La primera inmunohistoquímica, se realizó con Ac fluorescentes sobre tejidos frescos, como se hace en la actualidad en diversas enfermedades de la piel y el riñón, sin embargo, el método Avidina-biotina y el método peroxidasa, permiten amplificar la señal del cromógeno, favoreciendo la utilización de tejidos fijados en formol e inlcuidos en parafina.

La inmunohistoquímica o IHQ es una técnica que permite localizar moléculas en los tejidos  que han sido fijados en formol y embebidos en parafina, mediante el uso de anticuerpos. Esta técnica, por la gran especificidad y alta afinidad de los anticuerpos para reconocer moléculas y unirse a ellas, permite detectar cantidades ínfimas de moléculas presentes en el tejido.

Por otro lado, exponemos los conceptos básicos que permitirán la compresión técnica, entre ellos:

• Antígenos: son las sustancias capaces de producir la respuesta inmune.

Entre sus propiedades inmunológicas destacamos; inmunogenicidad (capacidad de producir una respuesta específica humoral o celular) y antigenicidad (capacidad de combinarse con anticuerpos y/o receptores de células).

• Epítopos: son cada uno de los sitios discretos de una macromolécula, reconocidos individualmente por un anticuerpo específico o por un TCR (receptor de linfocito T) específico. Son regiones inmunológicamente activas.
• Anticuerpos: también conocidos como inmunoglobulinas (Ig) son glicoproteínas del tipo gamma globulina. Pueden encontrarse de forma soluble en la sangre u otros fluidos corporales de los vertebrados, disponiendo de una forma idéntica que actúa como receptor de los linfocitos B y son empleados por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar elementos extraño. Estas se clasifican en función de la cantidad que se pueda hallar en el suero; siendo:

• IgG: es la única que es transmitida de la madre al feto.
• IgA: la encontramos en mayor parte en secreciones corporales.
• IgM: se encuentra circulante.
• IgD: se encuentra como molécula de membrana en los linfocitos B.
• IgE: aparece en alergias o infecciones por parásitos.

Las inmunoglobulinas presentan una estructura formada por dos tipos de cadenas proteicas; una de ellas conocida como cadena pesada y la otra como cadena ligera.

• Complejo antígeno-anticuerpo (Ag-Ac): se trata de la unión específica, consecuencia de uniones débiles como puentes de hidrógeno, fuerzas de Van Der Waals, interacciones electroestáticas e hidrofóbicas, con el fin de inhibir la toxicidad del Ag.

Esta reacción se caracteriza principalmente por la rapidez, especificidad, espontaneidad y reversibilidad.

Obtención de anticuerpos policlonales y monoclonales.

En el caso de los Ac policlonales, se obtienen administrando el antígeno a los animales, que bien pueden ser, conejos, ratones, cerdos, cabras, entre otros. Pero antes de inocular al animal, es necesaria una previa selección, en función de:

• La cantidad de antígeno disponible.[pic 2]
• La cantidad de anticuerpo o antisuero que se necesita.
• La relación filogenética entre las especies de origen del antígeno y la especia usada para obtener el antisuero.
• Uso que se le dará a los anticuerpos.

Con respecto a la vías de inoculación, tenemos la via intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal (en el caso del ratón) e intravenosa.

Entonces, los Ac policlonales, se obtienen mediante la introducción del antígeno deseado en el animal de experimentación, de forma que desencadena la respuesta inmune y la proliferación de diferentes clones de linfocitos B que reconocerán de forma específica cada uno de sus determinantes antigénicos. Una vez realizado todo el proceso, se extrae la sangre del animal, de la cuál obtendremos el suero donde se encuentran los Ac dirigidos al Ag con el que se realizó la inmunización (frente a todos los determinantes antigénicos) y también frente a otros Ag a los que se haya expuesto el animal previamente.

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Por otro lado, la obtención de Ac monoclonales, se consigue mediante la inmunización de un ratón con el Ag deseado y transcurrido un cierto tiempo, se extrae el bazo y se disgrega para obtener linfocitos B, que se fusionan con células de mieloma que presentan deficiencia en la enzima hipoxantina guanina fosfo ribosil transferasa (HGPRT) implicada en la síntesis exógena de ADN. Esta unión (célula de mieloma- linfocito B) se conoce como hibridoma, que es cultivado en un medio selectivo HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). La aminopterina bloquea la vía endógena, y sólo las células que puedan sintetizar ácidos nucleicos por la vía exógena (que sean HGPRT+) sobrevivirán. Los hibridomas formados por la fusión entre un linfocito y una célula de mieloma son capaces de crecer en este medio. A continuación se analizan los pocillos por Elisa (enzyme-linked immunosorbent assay), acuñado por Eva Engvall y Peter Perlmann, investigadores suecos que describieron el procediemiento en 1971. “Se trata de un método analítico que depende de la reacción Ag-Ac”. Además Dr. Elena González Rey, del Instituto de parasitología y biomedicina Lopez Neira, explica: “que se trata de una técnica bioquímica que permite detectar y cuantificar sustancias en distintos tipos de disolución”. Para ello se utiliza una placa de microtitulación donde se llevan a cabo incubaciones y reacciones necesarias, cuyo material es especial ya que permite la adhesión de proteínas al mismo.  Las placas deben ser previamente sensibilizadas con Ac, de forma que fijaremos los pocillos con Ac (por ejemplo de necrosis tumoral) a una concentración adecuada durante toda la noche y a una temperatura de 4º, de forma que los Ac quedan fijados a los pocillos y aquellos que no se hayan quedado unidos a la placa, se eliminan con el sobrenadante y se realizará tres lavados con un tampón PBS para la correcta eliminación de Ac que no se hayan adherido adecuadamente. A continuación se rellenan los pocillos con la solución de bloqueo, PBS + BSA (albúmina sérica bovina), que debe ser incubada por 2´ a temperatura ambiente, esto permite rellenar los espacios que los Ac 1º han dejado entre sí, de forma que en otras incubaciones no se produzcan uniones inespecíficas. A continuación se añade, la muestra problema (soluciones de diferente concentración) rellenando dos pocillos con la misma muestra problema y luego otros dos con otra de diferente concentración hasta rellenar los pocillos de interés y se incuba a 4º durante 12´, tras las cuales se retira el exceso de muestra que no se ha único a la placa y se añade el Ac 2º que es incubado durante 1 hora a temperatura ambiente y se une al Ag de la muestra y al Ag de concentración conocida de la curva estándar. Se realizan 6 lavados con el fin de eliminar el Ac 2º  que estaba unido a u una reacción colorimétrica en función de la cantidad de Ag presente  en la muestra, y se incuba a temperatura ambiente cubriéndolo, con el fin de que el proceso final sea en la oscuridad.  

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