Recuento de microorganismos en plaсa

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA GENERAL        UNJFSC        

UNIVERSIDAD NACIONAL

JOSÉ FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN

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ESCUELA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

CURSO:

MICROBIOLOGIA GENERAL

PRACTICA N°10:

“RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN PLACA”

PRESENTADO POR: GRUPO N° ….

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DOCENTE:

Ing. Edson Max Caro Degollar

HUACHO – 202…

PRÁCTICA DE LABORATORIO N° 10

1. TÍTULO: RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN PLACA

1. COMPETENCIAS:

• Aplica técnicas de homogenización y dilución de muestras para ser analizadas microbiológicamente.
• Emplea técnicas de siembra de microorganismos en diferentes tipos de medios de cultivo.
• Realiza cuantificación de microorganismos mediante las técnicas de recuento en placa.

1. FUNDAMENTO TEÓRICO.

Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso (biomasa) de células microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e indirectos. Entre los directos se pueden mencionar a la determinación de peso seco y el recuento de células en cámara de Neubauer.

La forma de cuantificar células viables más utilizada en Microbiología, es la de hacer diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo específicos para la población de interés. Esta técnica se basa en la suposición de que cada bacteria incluida en un medio de agar o en su superficie se multiplicará y producirá una colonia visible, en consecuencia, el número de colonias que se observarán a simple vista será igual al número de bacterias viables o unidades formadoras de colonias (UFC) inoculadas en el agar multiplicadas por la dilución. Esta técnica aplicada en muestras complejas, dará una estimación aproximada del número total de microorganismos, dependiendo del medio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones de incubación que favorezcan el crecimiento de todos los microorganismos. También pueden presentarse problemas relacionados con falta de homogeneidad de las diluciones y en la inoculación de las muestras, por lo que se pueden obtener bajos valores si es que las células no se separan bien y valores elevados si las tomas de las muestras se hacen del fondo del tubo donde se han concentrado por gravedad los microorganismos.

En microbiología las diluciones seriadas corresponden a un método empleado de manera rutinaria con el fin de aislar células microbianas viables desde muestras sólidas o líquidas y cuantificar su cantidad. Las células viables son aquellas con la capacidad de dividirse y formar descendencia y, en la mayoría de los casos es el tipo de células que interesa. A través del método de diluciones seriales una célula viable se puede aislar e identificar como una colonia o Unidad Formadora de Colonia – UFC.

Las diluciones seriales se realizan cuando el tamaño de las poblaciones microbianas en una muestra es demasiado alto, y sembrarlas en un medio sólido puede conducir a la no formación de colonias o fusión de estas haciendo difícil el aislamiento y recuento. Para obtener un número apropiado de células que puedan formar colonias aisladas en placa (entre 30 y 300 unidades formadoras de colonias UFC) se requiere de la dilución de la muestra y, como rara vez se conoce con antelación el número de células viables, normalmente se hace más de una dilución, siendo usual realizar diluciones decimales. Para hacer una dilución decimal de 10-1 se mezclan 1mL en 9 mL de diluyente. Si se necesita una dilución 10-2, se pueden mezclar 0.1mL con 9.9 mL o de modo seriado haciendo dos diluciones de tipo 10-1 así sucesivamente si se sospecha que la muestra esta densamente poblada. Si se parte de muestras sólidas o líquidas densas (suelos, alimentos, etc), para asegurar una muestra representativa, la primera dilución se realiza mezclando 10 g o 10 mL de muestra en 90 mL del diluyente.

Otros factores de relevancia en el método de diluciones seriales están relacionados con la homogenización de la muestra, el diluyente seleccionado y, la identificación de las muestras y cultivos. Generalmente, la liberación de las células desde las muestras al fluido posiblemente requiera de dispositivos de trituración y mezcla para lograr una buena homogenización. Como diluyente de uso general está el agua peptonada al 0.1%, aunque se puede trabajar con solución salina fisiológica con 0.1% de peptona. La identificación de la muestra se refiere a la forma como se debe rotular para no confundirla o perderla, el rotulo debe incluir: nombre y tipo de producto, fecha de recolección, cantidad, empaque, fecha de producción y de vencimiento, así como fecha de análisis y características organolépticas (color, olor, sabor, aspecto); los cultivos por su parte deben indicar el número de dilución, tipo de medio, nombre del analista y fecha.

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Figura 1. Método de las diluciones seriadas.

Métodos de siembra

Para la siembra de las diluciones seriales existen diferentes métodos, no obstante, los extendidos y usados son: el método de extensión en placa y el método de vertido en placa.

1. Método de extensión o siembra en superficie:

Un volumen que no suele ser superior a 0.1 mL, se extiende en la superficie de una placa con medio sólido, utilizando un asa estéril de extensión (asa digralsky). Es importante que la superficie del medio esté seca de modo que el líquido de la muestra se absorba y las células queden fijas. La placa se incuba a una temperatura adecuada hasta que aparecen las colonias.  

1. Método de vertido en placa o profundidad:

Se pipetea un volumen conocido (normalmente 1mL) de muestra en una caja Petri estéril sobre la que se añade el medio con agar fundido. Se realiza una mezcla con movimientos suaves de la placa sobre la superficie de la mesa antes de dejar solidificar. En este método se debe tener precaución con la temperatura del agar fundido, la cual debe mantenerse entre 45°C - 50°C, temperaturas superiores podrían matar las células. En la placa las colonias se forman por toda la caja y no solamente en la superficie.

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