SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFÍA DE

EXCLUSIÓN MOLECULAR

INTRODUCCION

La cromatografía es una técnica que permite la separación de

moléculas diferentes presentes en una misma muestra. El método está

basado en la circulación de una fase móvil (que arrastra a la mezcla de

compuestos a separar), a través de una fase estacionaria. Dependiendo de la

afinidad relativa que por ambas fases tengan los distintos compuestos

presentes en la mezcla resultará su separación.

La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada

filtración en gel o de tamiz molecular) es una de las técnicas más sencillas

de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo

de cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de

los geles que se fabrican con este fín y que pueden ser de varios tipos:

dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A),

poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se

hallan constituidos por gránulos (particulas) de un material esponjoso

hidratado, que contiene poros con un tamaño de diámetro determinado.

Hypothetical partial structure of sephacryl

Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a

través de una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un

tamaño mayor que el diámetro de los poros de las particulas, sólo podran

moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en el espacio que

queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán retrasadas en su

descenso. En cambio aquellas moléculas capaces de penetrar en las

partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida,

cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo

de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular.

Mecanismo de la cromatografía de exclusión

Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las particulas de menor

masa molecular. De ahí que las particulas de mayor peso molecular salgan

primero.

Diferentes compartimentos dentro de la columna

Diagrammatic representation of Vt and V0. Note that Vt – V0 will include

the volume of the actual fibres forming the matrix of each bead.

APLICACIONES

A) Cambios de buffers. Después de cromatografías de intercambio iónico,

afinidad o de interacción hidrofóbica.

B) Desalado. Proteínas, polisacáridos, polipéptidos etc. Pueden ser

desalados antes de ser concentrados o liofilizados.

C) Eliminación de fenol de las preparaciones de ácidos nucléicos.

D) Eliminación de compuestos de bajo peso molecular marcados. I125,

FITC de las soluciones de marcaje de proteínas.

E) Para reacciones entre macromoléculas y reactivos de bajo peso

molecular.

F) Eliminación de productos, cofactores, inhibidores, etc. De las enzimas.

G) Purificación de macromoléculas.

H) Determinación del peso molecular de las proteínas.

OBJETIVO

Realizar la calibración de una columna de gel filtración de sephacryl S-200

y

...