Separando Organelos

Separando Organelos

En los 50’s y 60’s, científicos usaron dos técnicas para estudiar los organelos celulares: microscopia y fraccionamiento. Christian de Duve fue la cara visible del fraccionamiento celular. A comienzos de los 50’s, el uso la centrifugación para distinguir un nuevo organelo, el lisosoma, producto de fraccionamientos anteriores se había podido caracterizar: el núcleo, la mitocondria rica en fracción, y los microsomas. Poco después, él utilizó centrifugación con equilibrio de densidades para descubrir un nuevo organelo.

Antecedentes

Las células eucariontes son altamente organizadas y están compuestas de estructuras celulares conocidas como organelos, las que realizan funciones específicas. Aunque la microscopía ha permitido a los biólogos describir la localización y apariencia de varios organelos, su uso se hace limitado en el descubrimiento de la función de cada organelo. Para hacer esto, los biólogos celulares se han basado en una técnica conocida como fraccionamiento celular. Aquí, las células se rompen, y los componentes celulares se separan en base al tamaño, masa y densidad, usando diversas técnicas de centrifugación. Entonces, los científicos podían aislar y analizar los componentes celulares de diferentes densidades, que se denominan fracciones. Usando este método, los biólogos tenían dividida la célula en cuatro fracciones: núcleo, mitocondria rica en fraccion, microcosmos, y savia celular.

De Duve fue un bioquímico interesado en las ubicaciones subcelulares de enzimas metabólicas. Él ya había realizado un gran trabajo sobre el fraccionamiento de las células del hígado, en el cual había podido determinar la localización subcelular de numerosas enzimas. Mediante la localización de estas enzimas en fracciones celulares específicas, él pudo comenzar a dilucidar la función de los organelos. Se ha señalado que su trabajo se basó en dos hipótesis: el "postulado de la homogeneidad bioquímica" y "el postulado de única ubicación". En resumen, estas hipótesis proponen que toda la composición de una población subcelular contendrá las mismas enzimas, y que cada enzima está localizada en un sitio discreto dentro de la célula. Armado con estas hipótesis y con la gran herramienta de la centrifugación, de Duve subdividió la mitocondria rica en fracción.

Primero, identificó la fracción ligera mitocondrial, que está compuesta de enzimas hidrolíticas que en la actualidad se conoce que son las que componen el lisosoma. Luego,

en una serie de experimentos que se describirán aquí, identificó otra discreta fracción subcelular, que él denominó peroxisoma, dentro de la fracción rica mitocondrial.

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de Duve estudió la distribución de enzimas en células hepáticas de rata. Altamente activo en el metabolismo energético, el hígado contiene un número de enzimas útiles para estudiar. Para encontrar la presencia de diversas enzimas durante el fraccionamiento, él se basó en ensayos ya conocidos, llamados ensayos de enzimas, para la actividad enzimática. Para conservar la máxima actividad enzimática, tuvo que tomar algunas precauciones, las que incluyen la realización de todas las etapas de fraccionamiento a 0° C, ya que el calor desnaturaliza las proteínas, lo que podría comprometer la actividad enzimática.

De Duve utilizó centrifugación zonal, para separar los componentes celulares en determinados pasos de centrifugación. Le sacó el hígado a la rata y lo rompió aparte, por homogeneización. La cruda preparación de células homogeneizadas fue sometida relativamente a centrifugación de baja velocidad. Este paso inicial separó el núcleo de la célula, él se encuentra como sedimento en el parte inferior del tubo, desde el extracto citoplasmático que se encuentra en el sobrenadante. A continuación, de Duve subdividió el extracto citoplasmático en fracción mitocondrial pesada, fracción mitocondrial de luz, y fracción microsomal. Él logró separar el citoplasma mediante el empleo de sucesivas etapas de centrifugación de una fuerza cada vez mayor. En cada paso, se recogen y almacenan las fracciones de la enzima para posterior análisis. Una vez que el fraccionamiento estuvo completo, de Duve realizó ensayos enzimáticos para determinar la distribución subcelular de cada enzima. Luego trazó gráficamente la distribución de las enzimas por toda la célula. Como se ha demostrado anteriormente, la actividad de la citocromo oxidasa, una enzima importante en el sistema de transferencia de electrones, se encontró principalmente en las fracciones mitocondriales pesadas. La fracción microsomal muestra contener a otra enzima previamente caracterizada

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