TERCER CURSO DEL GRADO EN BIOLOGIA.

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 REGULACION DE LA SEÑALIZACION CELULAR

PROTOCOLOS DE CLASES PRACTICAS

TERCER CURSO DEL GRADO EN BIOLOGIA

CURSO 2014-2015

INTRODUCCION

La señalización celular comprende un complejo conjunto de rutas cuya actividad regula y mantiene el funcionamiento celular, y cuya desregulación está implicada y/o es responsable de buen número de patologías humanas. El elevado nivel de conservación filogenética de gran parte de las rutas de señalización hace que su estudio en sistemas celulares y animales sea una potente herramienta que nos ayude a identificar y caracterizar los intermediarios moleculares, las interacciones y los procesos que transducen de manera recíproca las señales entre el medio extracelular y el interior celular.

En los últimos años se han desarrollado gran número de herramientas genéticas, moleculares y celulares que han desembocado en un avance sin precedentes en nuestra capacidad para entender, diagnosticar, prevenir y tratar la enfermedad. Gran parte de este avance es consecuencia directa de nuestra mejor comprensión de los mecanismos por los que la célula responde al entorno extra e intracelular. Junto a metodologías más clásicas de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, se dispone en estos momentos de una batería creciente de nuevas técnicas de Genómica, Proteómica, Metabolómica, Secretómica, Lipidómica y otras, que se espera contribuyan decisivamente a un tratamiento más específico y personalizado de la enfermedad humana. Son particularmente relevantes los nuevos métodos de secuenciación masiva de alto rendimiento, de análisis global de la expresión génica, de producción de modelos animales modificados genéticamente, de elaboración y screening de bases de datos a nivel genómico,

El objetivo principal de estas clases de laboratorio es mostrar, desde el punto de vista práctico y dentro de los recursos disponibles, algunas de las técnicas y protocolos experimentales que, ya sea por su frecuente aplicación en investigación y/o diagnóstico, ya sea por su valor conceptual, se consideran de interés. Estas clases prácticas incluyen la manipulación de cultivos celulares, la realización de ensayos de viabilidad y de muerte celular, el análisis de la migración celular, el aislamiento de DNA genómico y el genotipado por PCR y el estudio de cambios en los niveles de expresión génica por Western immunoblotting.

Las clases de laboratorio implicarán la realización de 4 protocolos experimentales y tendrán una duración de 20 h divididas en 5 sesiones de tarde. Dada esta limitación temporal, será preciso solapar la realización de dichos protocolos, lo que no supondrá, en ningún caso, comprometer el aprendizaje por parte del alumno.

La organización diaria de las tareas correspondientes a cada práctica se detalla en la tabla que se incluye al final del guión.

PRACTICA 1: GENOTIPADO DE DNA GENOMICO DE RATON

En esta práctica se llevará a cabo el aislamiento y la purificación de DNA genómico de cola de ratón por digestión proteolítica. El DNA genómico purificado será empleado para determinar el genotipo respecto al receptor de dioxina (AhR) de ratones silvestres de la cepa C57BL/6N (wt) y de ratones knock-out (KO) generados por recombinación homóloga en células embrionarias (Fernández-Salguero et al. Science, 1995; Santiago-Josefat et al., J. Mol. Biol. 2004).

1. Biopsias de las colas de ratón

• Seccionar una biopsia del extremo de la cola de longitud inferior a 1 cm y transferirlas de inmediato a un tubo eppendorf conteniendo 0.5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl pH 8.5 100 mM, EDTA 5 mM, SDS 0.2%, NaCl 200 mM, 100 mg/ml proteinasa K).
• Digerir toda la noche a 50ºC con agitación. Homogeneizar la digestión con vórtex. Centrifugar a 15.000 rpm (16.000 x g) durante 10 min a 4ºC.
• Retirar el sobrenadante con cuidado, procurando no arrastrar el precipitado que contiene material sin digerir. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio conteniendo 0.5 ml de 2-propanol. Invertir el tubo repetidamente hasta que aparezca el precipitado de DNA genómico.
• Recuperar el DNA con una punta de pipeta y transferirlo a un tubo nuevo conteniendo 80% de etanol. Lavar por inversión, centrifugar a 15.000 rpm durante 30 s a 4ºC.
• Retirar el etanol. Dejar secar el DNA a RT y disolver en 150-200 μl de tampón TE (Tris-HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM) toda la noche a 50ºC.

1. Reacción de PCR (polymerase chain reaction)

• Teniendo en cuenta la técnica de clonaje empleada para producir estos animales transgénicos y el método de genotipado diseñado, el alelo silvestre de AhR amplifica por PCR un fragmento de 500 bp mientras que el alelo mutante, en el que se insertó un fragmento de DNA de 1 Kbp origina un producto de PCR de 1.5 Kbp.
• Preparar la reacción de amplificación por PCR en un volumen final de 50 μl de una mezcla de reacción  que contiene: 25 μl de mezcla de reacción para PCR (incluye tampón de PCR, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM de cada dNTP y la enzima DreamTaq DNA polimerasa), 1 μl de DNA genómico aislado de las colas, 1 μl (50 pmoles) de oligonucleótido cebador específico WT2 (forward): 5´ GGCTAGCGTGCGGGTTTCTC 3´ y 1 μl (50 pmoles) del cebador WT5 (reverse): 5´ CTAGAACGGCACTAGGTAGGTCAG 3´; el volumen restante se completa con agua estéril.
• Llevar a cabo la amplificación en un equipo MJ Reaserch PT100 empleando las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95ºC durante 3 min y 30 ciclos desnaturalizando a 95ºC durante 1  min, hibridando a 56ºC durante 1 minuto y extendiendo la síntesis a 72ºC durante 3 min. Tras la reacción, las muestras se mantienen a 4ºC en el equipo.

1. Análisis de los fragmentos de PCR por electroforesis en geles de agarosa.

• Los fragmentos amplificados por PCR se analizarán en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio (EtBr)
• Preparar 150 ml de tampón TBE 1x (Tris base 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8.3) a partir de un stock 5x. Disolver en dicho tampón la cantidad necesaria de agarosa para que su concentración sea del 0.8% (p/v). Cuando se haya enfriado lo suficiente añadir 5 μl de EtBr 100mg/ml. Depositar el gel líquido en la bandeja de polimerización conteniendo un peine  de 15 pocillos.
• Tomar 25 μl de la reacción de PCR y mezclarlos con 4 μl de tampón de carga para DNA (azul de bromofenol 0.25% (p/v), azul de xileno 0.25% (p/v), glicerol 30% (v/v)). Cargar 30 μl de cada muestra en cada uno de los pocillos del gel de agarosa. Cargar en uno de los pocillos 10 μl de 1 Kbp DNA ladder.
• Desarrollar la electroforesis a 80 V durante 1 h 30 min. Visualizar y fotografiar en un transiluminador UV a 254 nm.

PRACTICA 2: WESTERN IMMUNOBLOTTING

Analizaremos en esta práctica cómo una disminución en la capacidad proliferativa de las células está asociada a una disminución en el nivel de expresión de la proteína PCNA (Proliferating-cell nuclear antigen), la cual tiene un papel relevante en la regulación de la transición G1/S del ciclo celular. Se empleará la línea celular inmortalizada a partir de epitelio murino NMuMG. Estas células serán analizadas en condiciones de proliferación activa, tras alcanzar confluencia y tras ser deprivadas de suero. Con ellos podremos ver si aquellas condiciones que inhiben proliferación implican cambios en los niveles de PCNA.

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