Trabajo Practico Nº5: Organización subcelular

[pic 1]

Trabajo Practico Nº5:

Organización subcelular

                                                                                                         Autores:

                                                                                                         Carmen Álvarez C.                                                                                                        

                                                                                                         Valentina González V.        

                                                                                                         Kathya Larenas R.

                                                                                                         Sección:

         307

                                                                                                         Profesores:                                                                                       

         María Soledad C.

         Marcelo Salazar        

Introducción

[…]La centrifugación es el primer paso en un esquema típico de purificación […]1

En este laboratorio se trabajara con la técnica de fraccionamiento subcelular, utilizando una centrifuga, la que consiste de un rotor con espacios para posicionar tubos de ensayos con muestras. El rotor gira a distintas velocidades y cantidad de tiempo según la fracción que se quiera conseguir.

Se utilizara un homogenizado crudo de una muestra de hígado de pollo previamente preparado, el cual se someterá a fraccionamiento subcelular tres veces  dando como resultado tres fracciones diferentes (nuclear, mitocondrial y microsomal), además se tendrán 5 tubos de ensayo con succinato , azul de metileno, agua destilada y vaselina, para luego agregar una muestra de la fracción que  corresponda a cada uno, teniendo como referencia negativa el tubo “blanco” el cual contiene solo las tres soluciones antes mencionadas luego los 5 tubos serán puestos en una incubadora.

Posteriormente se realizaran dos muestras de la fracción nuclear, una teñida con azul de tripán y otra sin teñir, las que serán observadas a microscopia óptica.

Como hipótesis se planteó que cada muestra de fraccionamiento subcelular presentara un color distinto ya que cada una estará formada de una fracción pura.

Objetivos

-Comprender el funcionamiento de las técnicas de fraccionamiento subcelular

-Reconocer los distintos fraccionamientos y entender por qué su coloración ante los reactivos.

-Distinguir las diferencias de una muestra con tinción y una sin tinción de la fracción nuclear.

Materiales y métodos

Para el fraccionamiento subcelular, se realizaron los siguientes procedimientos:

Los profesores prepararon un homogenizado filtrado a base de hígado de pollo, denominado homogenizado crudo (HC).

El cual fue entregado y se mantuvo en hielo, con un volumen de 10 ml, del cual se extrajo 1 ml y se guardó en un tubo eppendorf de 1.5 mL y se conservó en hielo.

Luego se centrifugaron los 9 mL restantes por 10 minutos a 4ºC.

Después se transfirió el sobrenadante 2 al tubo de centrifugación y se re suspendió el pellet 2 con 1 mL de suero frío, para centrifugarlo en una centrifuga por 20 minutos a 4ºC.

Posteriormente se guardó el sobrenadante 3.

Para continuar se observó en el microscopio los núcleos, para ello en un portaobjeto limpio y seco, y con la ayuda de un gotero se agregó una gota de la suspensión de núcleos, la cual se encontraba en hielo, luego sobre esta gota se colocó un cubreobjetos y se llevó a la platina del microscopio en donde se reguló con el micrométrico y el macrométrico,  donde finalmente se observó en aumento 40x.

A continuación de esto, se realizó el mismo procedimiento anterior, pero esta vez con la ayuda de un gotero se agregó 1 gota de azul de tripán, adicional a la gota de la suspensión de núcleos y nuevamente se observó en el microscopio en aumento 40x, para comparar las muestras.

...