Transformación Bacteriana de E. coli

Transformación Bacteriana de E. coli

Resumen:

        En éste experimento se estudió mediante la practica las técnicas de asepsia y estriado de una bacteria, con un fin de observar como un plásmido puede insertarse en el material genético de una bacteria llevando acabo una transformación.  Se utilizó puc19 como plásmido, y IPTH como inductor para poder visualizar el color azul de las colonias (bacterias transformadas),el objetivo final de éste experimento.   Mediante éste experimento se estudiaron los efectos de cambios en temperatura que afectan la permeabilidad de la membrana y facilitan el paso del plásmido por la membrana de ésta bacteria. Al finalizar no se observó una colonia, por ende no ocurrió una transformación.  Esto pudo haber sido por varias fuentes de errores, como por ejemplo que la bacteria estaba muerta, entre otras posibilidades.

Introducción:

Transformación bacteriana es un proceso mediante el cual las bacterias toman ADN extra-cromosomal e integran el mismo a su propio genoma.  Las bacterias son microorganismos simples, unicelulares,  que se adaptan rápidamente a condiciones inestables y pueden llevar a cabo mecanismos complejos con un fin, por ejemplo intercambiar información genética.  Debido a la transformación bacteriana se representa un mecanismo del cual  surge la resistencia a antibióticos  Este mecanismo utilizado por las bacterias, transformación bacteriana,  fue demostrado por Frederick Griffith en el 1928.  En el experimento a ser practicado se estudiará la transformación bacteriana mediante plásmidos.  Los plásmidos son moléculas circulares de ADN que se replican de manera independiente al cromosoma de la célula hospedera. La transformación que será estudiada, mediante plásmidos, se lleva a cabo cuando se introduce un plásmido nuevo capaz de replicarse y expresarse de forma independiente.  Muchas bacterias y organismos presentan alteraciones a su membrana celular como permeabilidad , lo que permite la penetración de ácidos nucleicos en la célula, iniciando un estado de competencia que requiere condiciones especiales de crecimiento.  Comúnmente solo algunas partes de la célula son competentes.  Inserción de un plásmido  que tiene resistencia a antibióticos es un estado fisiológico de la bacteria.  Esta resistencia es debido a que los genes produjeron proteínas  que degradaron los antibióticos y estas células se multiplicaron teniendo una descendencia que posee las características heredadas nuevas debido a la actividad de los plásmidos( Sánchez y Guerrero, 1982).  Actualmente existen tres tipos de recombinaciones de plásmidos transformantes.  Estos tres tipos son: recombinación entre plásmido y cromosoma receptor, recombinación entre plásmidos y la integración del plásmido en el cromosoma receptor.  

El propósito de esta investigación mediante la practica de la transformación bacteriana de E. Coli utilizando plásmidos.  Se practicaron las técnicas de asepsia, estriado y manejo de microorganismos y bacterias utilizando micro pipetas.  En base al procedimiento practicado los cambios en temperatura afectan la permeabilidad de las membranas bacterianas ocasionando un “heat shock” permitiendo que el plásmido entre a la bacteria, facilitando que ella pueda metabolizar X-gal y la misma tome un color azul.  De esto surgió la pregunta de cómo afectara a medida que cambia la temperatura la permeabilidad de la membrana bacteriana para que entre al plásmido.  La hipótesis de este experimente fue que si existe un cambio en temperatura esto afecta la permeabilidad de la membrana bacteriana haciendo que sea mas fácil la entrada del plásmido e interaccione con el material genético de la bacteria, de esto ocurrir se torna azul la bacteria o colonia.

Método:

Antes de comenzar el experimento se limpio el área de trabajo de acuerdo con las reglas de asepsia. Para comenzar se buscaron dos tubos los que se identificaron como BC y C1, respectivamente. Luego se añadió 1.5mL del cultivo de bacterias a cada uno. Se centrifugaron ambos tubos por un minuto a 7000rpm. Después de haber sido centrifugados se descarto el liquido restante, conocido como el sobrenadante. Se añadió con una micro pipeta 200μL de la solución de transformación TS a cada tubo y se mezclo con la punta de la pipeta. Luego se incubaron los tubos en un “beaker” con hielo por 20 minutos para hacer las bacterias competentes. Al finalizar los 20 minutos se transfirió el contenido del tubo BC o experimental al tubo BP ya que este contenía los plásmidos. Estos plásmidos se utilizaron para que la bacteria pudiera metabolizar lactosa o su análogo (x-gal). Ambos tubos, el BP y C1 se colocaron en el “beaker” con hielo por un periodo de 30 minutos. Al finalizar el tiempo ambos tubos se colocaron en incubación en un baño termal por 30 segundos a 42°C. Luego los tubos fueron colocados nuevamente en el “beaker” con hielo por 5 minutos. Este cambio repentino de caliente a frio ocasiona un “Heat Shock” lo cual permeabiliza la membrana de las bacterias para que el plásmido pueda entrar. Luego se añadió con una micro pipeta 200μL de LB, medio utilizado para cultivar bacterias, en cada tubo. Después ambos tubos se incubaron en un baño termal con movimiento a 37°C por un periodo de 23 minutos y 26 segundos. Durante el transcurso de los minutos de incubación se cogieron dos placas Petri y se rotularon. Para rotularlas se identifico una placa para el grupo experimental y otra para el grupo control, en ambas se puso la fecha, sección, organismo cultivado y las iniciales de los integrantes del grupo. Luego que transcurriera los  minutos, se removieron ambos tubos y se agitaron. Luego se transfirió 10μL de cada tubo a su respectiva placa Petri. Con un “Loop” de inocular previamente esterilizado se estrió cada placa para separar las colonias. Finalmente se colocaron las placas en la nevera por un periodo de 24 horas para observar el crecimiento de las mismas.

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