Tuberculosis En Odontologia

Inmunoanálisis enzimático sobre fase solida (ELISA)

Este método puede utilizarse para la cuantificación de antígenos y de anticuerpos en muestras de pacientes. Se basa en la unión covalente de una enzima con un antígeno conocido o con un anticuerpo, la reacción

Del material conjugado con la enzima con la muestra del paciente y la posterior determinación de la actividad

Enzirnática añadiendo el sustrato de la enzima.

Para determinar los anticuerpos, los antígenos conocidos se fijan sobre una superficie (p. ej. el fondo de unos

Pequeños pocillos sobre una placa de plástico), se incuban con diluciones del suero del paciente, se lavan

Y luego se incuban de nuevo con anticuerpos contra la IgG humana marcados con una enzima, como Ig peroxidasa.

La determinación de la actividad enzimática se realiza añadiendo el sustrato de la enzima y estimando la reacción colorimétrica en un espectrofotómetro. La cantidad de anticuerpo que se une es proporcional a la actividad enzimática. El título de anticuerpos en el suero del paciente indica la dilución más alta de suero que produce una reacción colorimétrica positiva.

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La técnica de enzimoinmunoanálisis de absorción (ELISA) utiliza un antígeno inmovilizado en una superficie, una bolita o un filtro de plástico con el objeto de capturar y separar un anticuerpo específico de otros anticuerpos presentes en el suero de un paciente (figura 18-5). El anticuerpo del paciente así fijado se detecta posteriormente por medio de un anticuerpo antihumano unido por un enlace covalente a una enzima (p. ej., peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, |3-galactosidasa). Se cuantifica por espectrofotometría en función de la intensidad del color producido como respuesta a la conversión de un sustrato adecuado Por la enzima. Se puede determinar la concentración real del anticuerpo específico por comparación con la reactividad de soluciones estándar de anticuerpos humanos. Las diversas modalidades de los análisis ELISA difieren en la forma en la que capturan o detectan los anticuerpos o los antígenos.

Las pruebas de ELISA también se pueden aplicar a la cuantificación de un antígeno soluble en una muestra de un paciente. En estos análisis, el antígeno soluble es capturado y concentrado por un anticuerpo inmovilizado y después se detecta con un anticuerpo diferente marcado con una enzima. Un ejemplo de un análisis ELISA que se utiliza comúnmente es la prueba doméstica de embarazo con la hormona gonadotropina coriónica humana. . MURRAY PAGINA 185

Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.

APARATO

Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA

FASES DE UN ENSAYO ELISA

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:

1. Conjugacion del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la técnica.

2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa poco antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa demasiado antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa.

3. Formación

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