Técnicas Histologicas

Se llama técnica histológica a la serie de pasos que han de darse para obtener un preparado

observable con el microscopio óptico. Es un proceso largo que abarca desde el momento en que se toma el material hasta que el preparado puede observarse.

PASOS:

1.- Toma de material.

2.- Fijación

3.- Deshidratación

4.- Preparación para la inclusión

5.- Inclusión

6.- Modelado del bloque – catalogación

7.- sección con el micrótomo extendido de los cortes – pegado

8.- Coloraciones: de rutina o especiales

1.- Toma de material:

Introducción:

Tratándose de un área de Histología el material ha de ser de un animal sano y normal.

Si es posible debe extraerse de un animal vivo y anestesiado, en caso contrario, al menos han de extraerse él o los órganos sanos lo más rápidamente posible después de la muerte.

La mayoría de las células consisten en una compleja membrana externa que rodea el protoplasma fluido, mezcla de soluciones de sales, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, ácidos orgánicos y enzimas. Si las células no fueron fijadas, mu chas de estas sustancias se perderán por solución simple, por diálisis o por ingurgitación osmótica de las células en el proceso que debe preceder al corte y a la tinción. En la técnica histológica muchos componentes texturales se pierden durante los sucesivos pasos de la misma. Los componentes que perduran son en gran medida moléculas grandes que no se disuelven con facilidad en especial después de aplicar el fijador.

Las moléculas grandes, particularmente aquellas que forman complejos con otras moléculas de gran tamaño, para producir compuestos macromoleculares, son las que mejor se conservan en un corte.

Ej: - Acidos nucleicos asociados con una proteína (nucleoproteína)

- Proteínas intracelulares del citoesqueleto que forman complejos con otras proteínas.

- Proteínas extracelulares en grandes agregados insolubles asociados con otras moléculas vecinas similares, a través de enlaces cruzados (como sucede en las fibras colágenas) y los fosfolípidos de las membranas.

Las proteínas y ácidos nucleicos “pequeños” como el ARN de transferencia en general se pierden durante la preparación de la muestra de tejido. Además pueden perderse moléculas grandes, por ej. Estas pueden ser hidrolizadas por un pH desfavorable en las soluciones fijadoras. Son ej. De moléculas grandes, que desaparecen durante la fijación de rutina en fijadores acuosos: el glucógeno, proteoglucanos y glucosaminoglucanos. También suelen perderse los lípidos neutros.

Al preparar muestras para su inclusión en parafina también se pierden moléculas pequeñas solubles o iones. Además y con el mismo propósito, la fijación debe hacerse muy cuidadosamente antes de proceder a la deshidratación.

Muestreo:

En cuanto la sangre deja de llevar oxígeno a los tejidos y de extraerles el anhídrido carbónico, las enzimas de las células que componen los tejidos comienzan a actuar y se produce la autolisis, las propias estructuras moleculares son deformadas, que es lo que precisamente se ha de evitar. Los tejidos y órganos se han de extraer considerando las siguientes prioridades:

- Las glándulas exócrinas y endocrinas lo más rápidamente posible.

- El páncreas y el riñón deben extraerse no más de 10 a 15 min. post-mortem.

- Otros órganos tales como intestino delgado y/o grueso, estómago, hígado, se deben extraer no más allá de los 30 min.

- Los músculos esqueléticos, huesos, piel, encéfalo, médula, ganglios nerviosos no deben extraerse más allá de 60 min. postmortem.

Material de necropsia:

El examen necrópsico debe ser realizado lo más rápidamente posible después de la muerte, si esto no es posible el animal debe ser colocado a 4° C. o sometido a embalsamamiento por vía arterial.

Procedimientos generales:

Si se extraen varios órganos se debe tener cuidado en registrar cada trozo de órgano envolviéndolo en una gasa o bien pasando un hilo directamente por un extremo del órgano, mientras quede el extremo opuesto se coloca un trozo de cartulina resistente donde se escribe con lápiz las indicaciones (órgano, porción, etc.) del caso, todo esto es necesario si las muestras a extraerse son muchas pues luego se verá dificultado el reconocimiento.

La cantidad de líquido fijador en microscopia óptica debe ser aproximadamente 10 a 20 veces el volumen de la muestra.

Los fragmentos de órganos no deben ser mayores de 1 cm de espesor; deben ser tomados en ángulos rectos a la superficie de los órganos y deben ser suficientemente profundos para comprender los constituyentes anatómicos normales como por ej. cápsula, corteza, médula, etc. A

veces pueden cortarse trozos de órganos de mayor tamaño, 2 o 3 cm y luego de algunas horas en

fijador en que las piezas están más fáciles de manejar, se realizan cortes más pequeños de los mismos.

¿Cómo realizar las secciones?

Los trozos de órganos tubulares se seccionan directamente con tijeras, los macizos han de ser

“desprendidos” con las tijeras. Extraídos los órganos deben seccionarse en fragmentos, para esto se debe utilizar una hoja de afeitar o de bisturí (se utilizan a manera de serrucho sin presionar). Los bordes cortados con tijeras se seccionan y se desechan, porque comprimen los órganos y los deforman.

2.- Fijación:

Concepto:

La fijación es una operación destinada a “matar” las células, conservándolas, cuanto sea posible en el estado en que están durante la vida.

Introducción:

Una buena fijación debe:

- inmovilizar la célula

- conservar exactamente todas las partes constitutivas.

- no hacer aparecer artificialmente otros detalles en la estructura.

Tal fijación es por ahora imposible de realizar.

Una acción rápida y enérgica del reactivo impide bien las alteraciones espontáneas postmortem, pero este modifica también la estructura celular.

Los mejores fijadores son los que además de actuar rápidamente producen el menor número posible de reacciones (modificaciones) secundarias o artificios, capaces de darnos una idea muy falseada de la morfología interna de la célula. Un tejido bien fijado mostrará células plenas, no vacuolizadas, ni hinchadas, ni arrugadas, sino presentando muchos detalles de estructura fina.

¿En qué consiste esencialmente la fijación?

Es verdad que la masa celular, formada de albuminoides, no puede ser conservada exactamente,

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