Técnicas para determinar mucopolisacáridos ácidos

1.3 TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS.


Los mucopolisacaridos ácidos son unos polisacáridos que no tienen grupos alcohólicos en posición 1,2 glicol sino grupos ácidos carboxilos o sulfatados.
Las técnicas para determinar mucopolisacáridos ácidos son principalmente:
a) Azul Alcián 
b) Reacción Metacromática

Técnica del Azul Alcián:

se ha comprobado que usando el azul alcián en condiciones de pH en torno a 2,4 -2,6 se colorean los mucopolisacáridos ácidos sulfatados y los carboxílicos.

Si por el contrario se emplea a un pH muy bajo, en torno a 1, sólo se colorea los mucopolisacáridos sulfatados, los carboxílicos no se tiñen. 
Si se sigue disminuyendo el pH hasta 0,5 se incrementa la selectividad de la tinción y en este caso sólo se tiñen los mucopolisacáridos fuertemente sulfatados.


Procedimiento Técnico:

Fijación: formol al 4%.

Soluciones:

Azul alcián a pH 2,5:

Azul alcián (C.I. 74240)…………… 1 g.

Ácido Acético 3%………………….. 100 ml.

Azul alcián a pH 1:

Azul alcián…………………………. 1 g.

HCl 0,1 N …………………………… 100 ml.

Azul alcián a pH 0,5 :

Azul alcián …………………………. 1 g.

HCl 0,5 N ………………………….. 100 ml.

Filtrar todas las soluciones antes de usar.
Las soluciones son estables durante 2 semanas aproximadamente, como colorante de contraste se puede usar una solución de Rojo nuclear al 1 %.


Modo de operar:

Desparafinar e hidratar.

Tratar con la solución deseada de azul alcián durante 30 min.

Si se usó la solución a pH 2,5, lavar con agua (d) ; si se usó cualquiera de los otros dos, secar sólo con papel de filtro.

Contrastar si se desea con rojo nuclear.

Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados:

Azul alcián a pH 2,5 los mucopolisacaridos ácidos (carboxilos y sulfatos) se tiñen de azul.

Azul alcián a pH 1 sólo se tiñen de azul los mucopolisacaridos ácidos sulfatados.

Azul alcián a pH 0,5 sólo se tiñen de azul los mucopolisacaridos ácidos fuertemente sulfatados.

b) Reacción Metacromática:
La metacromasia indica un cambio de color cuando un colorante químicamente puro tiñe selectivamente una estructura tisular de color “diferente”al de la solución diluida de colorante; se dice que ha ocurrido una reacción metacromática.
La estructura responsable de este cambio se llama cromotropa.
Para distinguirla de las restantes que se tiñen normalmente (ortocromáticas) 
Sustancias cromotropas son los mucopolisacaridos ácidos, ácidos nucleicos, lípidos de carácter ácido y partículas de sílice.
La reacción metacromática presenta grandes variaciones ante las más pequeñas modificaciones del medio donde reproduce, por lo tanto la reacción metacromática es de difícil interpretación e incluso puede proporcionar resultados contradictorios.

AZUL DE TOLUIDINA (técnica de metacromasia que mas se hace)

Fijación:

En el caso de los mucopolisacaridos ácidos pueden emplearse tejidos fijados con alcohol, Bouin alcohólico e incluso formol pero deben evitarse los fijados con agentes oxidantes.

Soluciones:

Solución Tampón de ácido acético - acetato a pH 4,2:

Acetato sódico……………. 2,7 g.

H2O (d)……………………. 100 ml.

Ácido acético 0,5 M……….. 1,1 ml

H2O (d)…………………….

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