Uso de inmunohistoquímica y técnicas moleculares en medicina forense

USO DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y TÉCNICAS MOLECULARES EN EL CAMPO FORENSE.

INTRODUCCIÓN

Las tareas esenciales de la patología forense implican la investigación de la causa y el proceso de la muerte, especialmente en las muertes súbitas traumáticas e inesperadas.

El objetivo principal del uso de la bioquímica post mortem así como de la biología molecular es investigar los cambios fisiopatológicos sistémicos implicados en el proceso de muerte que generalmente no pueden detectarse mediante métodos morfológicos. Estos procedimientos son útiles para investigar el proceso de muerte y reforzar la morfología y toxicología, también son importantes para detectar causas de muerte sin alteraciones morfológicas en periodo post mortem temprano (hasta las 48 horas) (1). En el caso de las pruebas moleculares de ADN, tienen aplicaciones en relacionamiento con muestras biológicas, establecimiento de parentesco, e identificación de individuos.

INMUNOHISTOQUÍMICA

La inmunohistoquímica es una técnica empleada para identificar constituyentes celulares o tisulares (antígenos) por medio de interacciones antígeno – anticuerpo; el sitio de unión del anticuerpo se identifica mediante marcaje directo del anticuerpo, o mediante el uso de un método de marcaje secundario. (2)

Los métodos de tinción inmunohistoquímica incluyen el uso de anticuerpos marcados con fluoróforo (inmunofluorescencia) y enzimáticos (inmunoperoxidasa) para identificar proteínas y otras moléculas en las células (2).

Esta técnica es necesaria para evaluar y determinar si una lesión se ha instaurado en vida o después de la muerte; y en caso de haber aparecido en vida, establecerá el momento en que se ha producido el daño.

Para determinar la data de las lesiones, los anticuerpos utilizados son variados y principalmente se encaminan a marcar los mediadores del proceso inflamatorio y reparativo de éstas, como son los componentes de la matriz extracelular, mediadores inflamatorios, y factores de crecimiento. Algunas de las tinciones inmunohistoquímicas usadas son mostradas en la tabla 1 (3).

Debemos tener en cuenta que la degradación de proteínas después de la muerte afecta a las tinciones inmunohistoquímicas. Si bien es cierto que una gran parte de las veces las autopsias medicolegales se realizan en un intervalo corto después de la muerte, no es de extrañarse que haya ocasiones en que se realizan en intervalos largos o incluso desconocidos, donde se pueden encontrar cuerpos con cambios de descomposición general, como decoloración de la piel, vetas, deslizamiento de la piel, momificación y esqueletización. En estos cambios mencionados, se pueden producir falsos negativos, así como positividad inespecífica; además de que la fijación y procesamiento de muestras de tejido pueden causar mayo pérdida de antígenos (4).

Son varias las técnicas que se pueden aplicar a las muestras forenses para estimar la edad de las lesiones. En patología forense se considera a la inmunohistoquímica como un método adecuado debido a su uso con tejido incluido en parafina fijado con formalina. Además, este método permite que la localización del marcador se detecte con precisión dentro de estructuras como tejidos y células (5).

Tabla 1 Métodos inmunohistoquímicos para el estudio de la evolución de las lesiones. (3)

[pic 1]

A pesar de esto, las técnicas de inmunohistoquímica no son usadas con tanta frecuencia entre los patólogos forenses, en comparación con los patólogos quirúrgicos. Los argumentos más utilizados en contra de este método incluyen los costos y el tiempo de respuesta, los hallazgos de condiciones médicas que no son la causa definitiva de muerte, y que el rendimiento diagnóstico de la tinción de inmunohistoquímica post motem no es suficientemente alto como para justificar los costos adicionales de su empleo (4). Otras ventajas y desventajas son mencinonadas a continuación:

Ventajas:

• Se ve la ubicación y distribución de las proteínas.
• Detectable en biopsias de tejidos pequeños y grandes y tejidos fijos.
• Validación de otros estudios de alto rendimiento (DNA microarray) (2)

Desventajas:

• Capacidad limitada para cuantificar el contenido de proteína.
• Problemas con los tipos de anticuerpos, capacidad limitada para detectar modificaciones proteicas.
• Criterios limitados o falta de evidencia.
• Métodos de puntuación variable y reproducibilidad.
• Sin métodos de normalización.
• Rendimiento limitado.
• Capacidad limitada para el perfil clínico de biomarcadores (solo con micromatrices de tejido) (2)

Por último, hay que tener en cuenta el intervalo de tiempo efectivo para realizar esta tinción, ya que éste se extiende hasta los tres días posteriores a la muerte del individuo y generalmente se asocia con una inmunohistoquímica exitosa de tejidos hepáticos, pulmonares y cerebrales con todos los anticuerpos. Posterior a ese tiempo, la tasa de tinción disminuye (4).

TÉCNICAS MOLECULARES

Estas técnicas están basadas en la identificación de marcadores y secuencias polimórficas en el ADN con un alto poder de precisión, y desde su descubrimiento, las metodologías analíticas y los marcadores genéticos usados en el campo forense han avanzado paulatinamente. Los propósitos de estas técnicas incluyen el establecimiento de relaciones de parentesco, la vinculación de un individuo con evidencia biológica obtenida de una escena de crimen, y la identificación de individuos. Son consideradas el gold standard de evidencia en este ámbito (6).

Cabe mencionar que estas pruebas no indican características físicas o patológicas de la persona, puesto que analizan secuencias que no codifican proteínas (6).

Hasta parte de la década de 1980, los tipos de sangre eran importantes como marcadores genéticos, así como el análisis de huellas dactilares. Sin embargo, se volvieron obsoletos como herramienta de identificación personal /establecimiento de parentesco debido a su bajo potencial discriminatorio y a los grandes avances en la tecnología del ADN. Los grupos de células sanguíneas, proteínas séricas y otros marcadores genéticos clásicos fueron sustituidos gradualmente por repeticiones cortas en tándem (STRs), polimorfismo de ADN mitocondrial y otros polimorfismos de nucleótido único (SNPs) (7).  

En cuanto al ADN, tenemos que está dividido en ADN nuclear y ADN mitocondrial. El ADN nuclear es la herencia de los padres, se encuentra en el núcleo formando una doble hélice y su célula es diploide, está compuesto por 46 cromosomas. Un 25% del genoma nuclear tiene la propiedad de producir proteínas, por lo que es llamado ADN codificante o expresivo; mientras el 75% restante no posee dicha propiedad, es no codificante.

Con respecto al ADN mitocondrial, es una pequeña porción de ADN propio de las mitocondrias. Las mitocondrias son las organelas responsables de proveer energía a las células en forma de adenosín trifosfato (ATP) mediante la vía de la fosforilación oxidativa, la β oxidación de los ácidos grasos y el metabolismo de aminoácidos y carbohidratos obtenidos de los alimentos. Esta pequeña porción de ADN mitocondrial es de herencia materna, es decir, únicamente lo transmite la madre a sus hijos, mientras que la del ADN nuclear se hereda de ambos padres. De forma similar ocurre en el linaje paterno con el cromosoma Y (8).

La exclusividad masculina del cromosoma Y resulta especialmente útil en casos de agresión sexual, en los cuales permite el estudio directo del genotipo del agresor en mezclas de células femeninas y masculinas, además de dar información con respecto al número de aportantes en casos de agresiones por varios individuos (9). La prueba del cromosoma Y también es empleada para demostrar relación paterno – filial, ya que el padre hereda el cromosoma Y a los hijos, por lo que todos los varones de una misma familia poseerán el cromosoma Y en común (10).

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