Virologia. Los rotavirus son virus ARN

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Resumen.

Se obtuvo el RNA de rotavirus para realizar un análisis de su genoma, por diferentes técnicas como; extracción de RNA por fenol-cloroformo, electroforesis y tinción con nitrato de plata.

Introducción.

Los rotavirus son virus ARN, miembros de la familia Reoviridae; descubiertos por  la Dra. Ruth Bishop y son la principal causa de diarrea en el mundo puesto que es el causante de aproximadamente 611.000 muertes por año.

Se han identificado 7 grupos antigénicos  de rotavirus (A, B, C, D, E, F y G). Los virus del grupo A son los que producen infecciones habituales en el ser humano y constituyen causas importantes de diarrea del lactante; mientras que en los animales los grupos que los afectan son el D y E; Los virus del grupo B han causado grandes brotes de gastroenteritis en adultos y niños. La principal vía de transmisión es la fecal-oral.

Existen diversas pruebas comerciales de ELISA y de aglutinación del látex para detectar virus en las heces. Las pruebas de látex son más sencillas y económicas pero poseen baja especificidad y sensibilidad. Los virus también puede ser identificado por aislamiento viral y microscopia electró- nica. Se puede efectuar el análisis epidemiológico de las cepas mediante la determinación de los patrones de migración del ARN viral en electroforesis en gel de poliacrilamida. Esta metodología es muy útil para caracterizar virus causantes de brotes en la comunidad o intrahospitalarios.

La técnica de electroforesis en gel es un método para separar, identificar y purificar DNA, RNA o proteínas, entre las más utilizadas se encuentra la de azarosa la de poliacrilamida para proteínas y ácidos nucleicos pequeños. La localización de la biomolécula en el gel puede ser determinada mediante la utilización de distintos colorantes que tienen afinidad específica por la biomolécula a resolver.

Objetivos

• Observar y analizar el genoma de rotavirus por medio de la rotaforesis.

• Identificar tipo de rotavirus en los carriles dependiendo de los electroferotipos que se corrieron (largo o corto).

Metodología

Extracción de ARN por Fenol-Cloroformo.

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Electroforesis en gel de poliacrilamida.

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Tinción Argéntica

-Retirar el gel del soporte                           -Lavar para retirar todo exceso de buffer del gel.

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Resultados

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Figura 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida que muestran electroferotipos caraterísticos del genoma de rotavirus.

Discusión

El fenómeno denominado electroforesis sucede cuando una molécula con una carga neta en solución se desplaza por acción de una campo eléctrico; de esta manera la molécula migra hacia uno u otro electrodo según su carga: los aniones(-) irán hacia el ánodo (+) y los cationes (+) hacia el cátodo (-). En estas condiciones las moléculas disueltas migran a una velocidad proporcional a la relación carga:masa. Por lo tanto la velocidad de migración en estas condiciones a través del campo eléctrico dependerá de: carga neta, tamaño y forma de la molécula, fuerza del campo eléctrico, fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio(1).  En la practica se logro la aplicabilidad de gel para la separación de proteínas que en presencia de radicales libres proporcionados por el persulfato de amonio (APS) y estabilizados por el TEMED, generan una reacción en cadena  iniciada con monómeros de acrilamida que polimeriza largas cadenas que son entrecruzadas con la bis-acrilamida para formar la matriz del gel y la cual es inhibida por el oxígeno. Se puede utilizar un sistema de buffers; continuo que tiene una única clase de gel, el separador y usa el mismo buffer que el de corrida; y el discontinuo que esta formado por dos geles distintos(2).

 El genoma de los rotavirus está conformado por 11 segmentos de dsRNA que pueden ser separados en 8 a 11 bandas y que en diferentes partes del mundo se han caracterizado electroforéticamente numerosas cepas de rotavirus(4).

De las muestras analizadas, se observaron 2 que fueron positivas para rotavirus (pocillo 3 y 4) por la tecnica de electroforesis en gel de poliacrilarnida. EI bajo porcentaje de rotavirus encontrado puede deberse, a que los pacientes muestreados son ambulatorios con cuadra clínico no agudo y la mayoria con diarrea semisolida, en tanto que los rotavirus son causantes de gastroenteritis aguda, caracterizada por diarrea liquida de dificil recoleccion. Se sabe que esta tecnica tiene baja sensibilidad respecto a la técnica serológica. Los rotavirus examinados presentan los 8 segmentos de dsRNAs genomicos distribuidos en cuatro regiones y pueden ser incluidos en el grupo A(3).

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