Determinación De La Actividad Enzim á Tica De Peroxidasas (catalasa
Enviado por duvanernesto97 • 26 de Mayo de 2013 • 1.247 Palabras (5 Páginas) • 1.489 Visitas
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE PEROXIDASAS
(CATALASA)
Cedillo Jiménez, C.A.
1
; Hernández López, J.L.
2
.
1
Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Querétaro.
2
Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico en Electroquímica.
RESUMEN
Se determino la actividad enzimática de la catalasa en una muestra de sangre fresca, variando
condiciones de pH (tres niveles: 4.96, 6.94 y 9.04) y de concentración de sustrato (siete
niveles: 0.0042, 0.0083, 0.0166, 0.0332, 0.0415, 0.0498 y 0.0664
M), titulando con
permanganato de potasio el peróxido de hidrogeno remanente. Se encontró diferencia
significativa entre ambas variables (pH y concentración de sustrato). Se encontró que a mayor
concentración de sustrato (en el intervalo de concentracione
s manejadas), el efecto en la
velocidad era positivo; entre pH 6.94 y 9.04 se encontró mayor efecto en la velocidad, el pH
4.96 se mantuvo debajo de ambos niveles. Se trato la enzima como si ésta se ajustara a un
perfil de Michaelis
-
Menten y se estimaron l
os parámetros cinéticos usando ajustes lineales
ponderados por el arreglo de Lineweaver
-
Burk y Hanes. Se encontró que la catalasa no se
ajusta a un perfil Michaelis
-
Menten, por ello es necesario estimar los parámetros con el patrón
adecuado.
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas con capacidad de catalizar reacciones biológicas. Igual que los
catalizadores inorgánicos, aumentan la velocidad para alcanzar el equilibrio de la reacción. El
mecanismo por el cual las enzimas incrementan la velocidad de la reacc
ión es reduciendo la
energía libre de activación requerida para la transformar un sustrato al producto
correspondiente, sin afectar la constante de equilibrio.
La actividad de una enzima se evalúa en función de la velocidad de la reacción. La cinética
enzimática
estudia la velocidad de la reacción, los factores que la modifican y el mecanismo
de la misma. Los factores fisicoquímicos que modifican la actividad de la enzima son:
concentración del sustrato, concentración de la enzima, pH, temperatura, fuerza iónica,
inhibidores.
Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913, propusieron un modelo clásico para el estudio de
la cinética enzimática. Este modelo consiste en graficar la velocidad de la actividad
enzimática y la concentración del sustrato. Esta representación gráf
ica permite determinar la
constante de Michaelis
-
Menten (K
M
) al interpolar la mitad de la velocidad máxima (V
máx
).
En esta práctica se emplear
á la enzima catalasa
para analizar algunos aspectos de la cinética
enzimática.
La catalasa u
tiliza una molécula de
peróxido de hidrógeno (H
2
O
2
) como sustrato
donador de electrones y otra molécula de H
2
O
2
como oxidante o aceptor de electrones.
Donde:
A y B
= Sustratos
C y D
= Productos
v
1
= Velocidad de
reacción para formar productos
v
2
= Velocidad de reacción para formar reactivos
v
1
v
2
CATALASA
2 H
2
O
2
2 H
2
O
+ O
2
La catalasa está
contenida en los peroxisomas de eritrocitos, médula ósea, mucosas, riñón e
hígado. Su función es la descomposición del H
2
O
2
formado por acción de las oxidasas.
OBJETIVO GENERAL
Analizar algunos
factores que inciden sobre la actividad enzimática de la
catalasa.
PARTE EXPERIMENTAL
Determinación de la actividad enzimática de la catalasa: Se empleo un método indirecto,
siguiendo el procedimiento descrito por
Garzon
(
2002
)
. Se realizo el experimento por
triplicado, con un sistema aleatorizado para evitar s
acar conclusiones erróneas en la perdida
de actividad enzimática por el tiempo entre la preparación de la solución y la prueba
enzimática; el orden de las corridas se describe en el Cuadro 1.
Cuadro 1. Orden de pruebas enzimáticas, según el día de experim
entación y el pH de trabajo.
Nota: Se considera un par de puntos para el orden de corrida debido a que se experimenta con la enzima y con
su blanco, el cual debe ser igual en las condiciones del primero a excepción de la adición de catalasa.
Matraces (Bla
nco
-
Enzima)
Orden de
Corrida
Día 1
Día 2
Día 3
Día 4
Día 5
pH
9.04
pH
6.94
pH
4.96
pH
4.96
pH
6.94
pH
9.04
pH
6.94
pH
9.04
pH
4.96
1
7
-
8
13
-
14
9
-
10
9
-
10
13
-
14
7
-
8
13
-
14
7
-
8
9
-
10
2
13
-
14
7
-
8
3
-
4
3
-
4
7
-
8
13
-
14
7
-
8
13
-
14
3
-
4
3
9
-
10
3
-
4
7
-
8
7
-
8
3
-
4
9
-
10
3
-
4
9
-
10
7
-
8
4
1
-
2
1
-
2
5
-
6
5
-
6
1
-
2
1
-
2
1
-
2
1
-
2
5
-
6
5
11
-
12
5
-
6
13
-
14
13
-
14
5
-
6
...